【摘要】：癲癇性發(fā)作定義為“由于過度的同步化的大腦神經(jīng)元活動而導(dǎo)致的一種短暫的征兆和/或征象。”一群神經(jīng)元突發(fā),暫時性同步化活動的原因尚不明確。大量研究表明干擾腦的能量代謝與顳葉癲癇(Temporal lobe epilepsy,TLE)的病理生理相關(guān),而星形膠質(zhì)細胞最重要的功能就是維護大腦能量自穩(wěn)態(tài)。對這一狀況的更好地了解將提供給神經(jīng)科學(xué)家和內(nèi)科醫(yī)師關(guān)鍵性的信息從而使其能夠開發(fā)出對患者有益的進一步的治療措施。預(yù)處理指的是細胞,器官或者有機體暴露于亞致死的損傷而產(chǎn)生的對隨后嚴重損傷保護作用。接近且低于細胞損傷閾值的傷害性刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)從而保護器官抵抗進一步的同種損傷(耐受)或者不同損傷(交叉耐受)刺激。盡管發(fā)現(xiàn)癲癇預(yù)處理,輕微的癲癇發(fā)作能夠保護神經(jīng)元抵抗后續(xù)癲癇持續(xù)狀態(tài)(Status epilepticus,SE),也能保護神經(jīng)元抵抗缺血。但很少有研究關(guān)注是否缺氧/缺血預(yù)處理也能夠?qū)ι窠?jīng)元提供保護作用而抗癲癇。缺血/缺氧時,星形膠質(zhì)細胞釋放的乳酸在能量危機時被神經(jīng)元吸收作為能量。主要在星形膠質(zhì)細胞上表達的單羧酸轉(zhuǎn)運體-4(Monocarboxylate transporter 4,MCT4)的生理角色與這一過程密切相關(guān)。哺乳動物體內(nèi)普遍表達的低氧誘導(dǎo)因子1α(Hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)是重要轉(zhuǎn)錄因子之一,其通過對缺血/缺氧的及時應(yīng)答以保持體內(nèi)氧平衡。缺血/缺氧信號刺激HIF-1α上調(diào),進而調(diào)控多種下游靶基因,通過促進紅細胞和血管新生,達到改善組織缺血/缺氧的目的。MCT4基因恰好是HIF-1α的眾多靶基因之一。本研究的目的在于證明以下假設(shè),缺氧預(yù)處理可以通過上調(diào)MCT4的表達為神經(jīng)元提供保護而起到抗癲癇作用。通過形態(tài)學(xué),分子生物學(xué)和行為學(xué)的方法比較了缺氧處理對培養(yǎng)原代大鼠星形膠質(zhì)細胞及間斷缺氧預(yù)處理(Intermittent hypoxia preconditioning,IHP)對氯化鋰-匹魯卡品癲癇模型大鼠的作用。結(jié)果表明缺氧會明顯上調(diào)原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞的MCT4,間斷缺氧預(yù)處理5日可以為癲癇模型大鼠提供最強大的抗癲癇作用。這一保護作用在標(biāo)準(zhǔn)化間斷缺氧預(yù)處理后第3日最為明顯。本實驗分為以下四個部分:第一部分:糖氧剝奪處理對離體培養(yǎng)原代大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞MCT4表達的影響目的:通過對SD大鼠原代海馬星形膠質(zhì)細胞的免疫印跡和免疫細胞化學(xué)分析,對比正常或缺氧條件下MCT4在星形膠質(zhì)細胞上的表達情況。方法:培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞隨機分為對照組與缺氧組。缺氧組細胞進行糖氧剝奪(Oxygen glucose deprivation,OGD)處理8h。恢復(fù)至正常培養(yǎng)條件下24小時后,培養(yǎng)皿中細胞收集進行MCT4的免疫印跡檢測,爬片上的細胞雙標(biāo)MCT4和星形膠質(zhì)細胞標(biāo)記膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)。結(jié)果:免疫印跡及雙標(biāo)免疫熒光染色均表明,經(jīng)過8小時的OGD處理,缺氧組星形膠質(zhì)細胞的MCT4表達水平較對照組明顯升高(P0.05)。結(jié)論:缺氧處理可以明顯誘導(dǎo)培養(yǎng)的原代星形膠質(zhì)細胞上MCT4表達上調(diào)。第二部分:間斷缺氧預(yù)處理對大鼠海馬MCT4及HIF-1α表達的影響目的:通過對不同間斷缺氧預(yù)處理周期SD大鼠海馬MCT4、HIF-1α,GFAP及神經(jīng)元抗核抗體(neuronal nuclei,Neu N)的免疫印跡、雙標(biāo)免疫熒光及免疫組化分析,確定標(biāo)準(zhǔn)化大鼠間斷缺氧預(yù)處理周期。方法:36只大鼠被隨機均分對照組和5個間斷缺氧預(yù)處理組。間斷缺氧預(yù)處理組大鼠分別給予間斷缺氧預(yù)處理1d,3d,5d,7d和14d。預(yù)處理結(jié)束后24h,每組3只大鼠取海馬進行MCT4和HIF-1α的免疫印跡檢測,另3只大鼠取鼠腦免疫熒光雙標(biāo)MCT4、GFAP和Neu N。結(jié)果:免疫印跡分析表明IHP組HIF-1α表達峰值出現(xiàn)在IHP 3d時間點,MCT4表達的峰值出現(xiàn)稍顯滯后在5d時間點,隨后二者表達逐漸下降。相比對照組及IHP 14d組,HIF-1α表達在IHP 3d組升高最為明顯(P0.05),MCT4表達在IHP 5d組升高最為明顯(P0.05)。大鼠海馬CA1區(qū)MCT4的免疫熒光標(biāo)記與免疫印跡分析的變化趨勢一致。然而,海馬CA1區(qū)GFAP及顳葉皮層Neu N的免疫組化染色不會被IHP預(yù)處理所影響。結(jié)論:間斷缺氧預(yù)處理會明顯誘導(dǎo)海馬MCT4和HIF-1α上調(diào),但不會引起器質(zhì)性腦損傷。因此,間斷缺氧預(yù)處理5日被確認為本研究中標(biāo)準(zhǔn)化的IHP預(yù)處理預(yù)處理周期。第三部分:間斷缺氧預(yù)處理對氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠癲癇易感性的影響目的:為了進一步闡明癲癇易感性與大鼠海馬MCT4和HIF-1α表達變化之間的關(guān)系,對IHP預(yù)處理后癲癇模型大鼠進行了電生理監(jiān)測,行為學(xué)觀察,免疫印跡和雙標(biāo)免疫熒光分析。方法:99只大鼠隨機均分為9組:對照組,癲癇組(僅注射氯化鋰-匹魯卡品誘發(fā)癲癇),缺氧預(yù)處理組(僅僅進行5天間斷缺氧預(yù)處理)和6個缺氧預(yù)處理-癲癇組。在標(biāo)準(zhǔn)間斷缺氧預(yù)處理后第1日(IHP-1d seizure組),第2日(IHP-2d seizure組),第3日(IHP-3d seizure組),第5日(IHP-5d seizure組),第7日(IHP-7d seizure組)和第14日(IHP-14d seizure組),各組分別注射氯化鋰-匹魯卡品誘發(fā)癲癇。誘發(fā)后,癲癇組及6個缺氧預(yù)處理-癲癇組的各3只大鼠進行電生理監(jiān)測4小時,另外8只進行4小時行為學(xué)觀察。依據(jù)改良的Racine評分法每5min進行一次發(fā)作行為學(xué)評分持續(xù)4小時。同時也記錄全身性發(fā)作達到4級的潛伏期和全身性發(fā)作百分比(評級為4和5級占所有評級時間點的百分比)。癲癇誘發(fā)后24小時海馬MCT4,HIF-1α和GFAP的表達是通過免疫印跡分析以及免疫熒光雙標(biāo)進行評價的。結(jié)果:癲癇組大鼠的背景腦電顯示出全面強直陣攣性的癲癇樣異常包括多棘波異常和棘慢波放電。IHP-3d seizure組大鼠的背景腦電僅出現(xiàn)偶發(fā)性的癇樣放電。誘發(fā)癲癇的改良Racine評分平均峰值在氯化鋰-匹魯卡品注射后50-150分鐘之間,然后逐漸消退。IHP-3d seizure組大鼠的平均改良Racine評分明顯低于其余各組。IHP-3d seizure組大鼠的全身性發(fā)作潛伏期和全身性發(fā)作百分比相比癲癇組大鼠的參數(shù),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。免疫印跡分析表明與癲癇組相比,MCT4和HIF-1α的表達在單純IHP組,IHP-3d seizure組以及IHP-5d seizure組均明顯上調(diào)(P0.05)。免疫熒光雙標(biāo)表明相比癲癇組大鼠海馬齒狀回(hippocampal Dentate Gyrus,DG)MCT4的表達在IHP-3d seizure組上調(diào)最為明顯,而GFAP的表達并無變化。結(jié)論:標(biāo)準(zhǔn)化的IHP預(yù)處理可以通過上調(diào)海馬區(qū)MCT4和HIF-1α的表達而為大鼠提供最大的抗癲癇保護作用。癲癇耐受效果在IHP后第3日最為明顯。第四部分:乳酸轉(zhuǎn)運功能的干擾對IHP預(yù)處理所誘導(dǎo)的大鼠癲癇耐受的影響目的:為了進一步闡明是否乳酸轉(zhuǎn)運功能的干擾將阻斷大鼠癲癇耐受的保護作用,對經(jīng)歷了不同處理的癲癇模型大鼠進行了電生理監(jiān)測,行為學(xué)觀察,免疫印跡和雙標(biāo)免疫熒光分析。方法:33只大鼠隨機均分為3組:癲癇組(僅注射氯化鋰-匹魯卡品誘發(fā)癲癇),間斷缺氧預(yù)處理-癲癇組(標(biāo)準(zhǔn)間斷缺氧預(yù)處理后72小時,注射氯化鋰-匹魯卡品誘發(fā)癲癇)和間斷缺氧預(yù)處理-抑制劑-癲癇組(該組大鼠經(jīng)歷與缺氧預(yù)處理-癲癇組同樣的程序,只是在匹魯卡品注射前4小時,腹腔注射α-氰基-4-羥基肉桂酸乙酯(CHC,90mg/kg,美國Sigma公司)這是一種特異性的線粒體乳酸和丙酮酸的共價轉(zhuǎn)運抑制劑)。誘發(fā)后,各組的3只大鼠進行電生理監(jiān)測4小時,另外8只進行4小時行為學(xué)觀察。記錄與第三部分相同的行為學(xué)參數(shù)。癲癇誘發(fā)后24小時海馬MCT4,HIF-1α和GFAP的表達是通過免疫印跡分析以及免疫熒光雙標(biāo)進行評價的。結(jié)果:間斷缺氧預(yù)處理-抑制劑-癲癇組大鼠的背景腦電同癲癇組一樣顯示出全面強直陣攣性的癲癇樣異常,而間斷缺氧預(yù)處理-癲癇組大鼠的背景腦電僅出現(xiàn)偶發(fā)性的癇樣放電。誘發(fā)癲癇的改良Racine評分平均峰值在氯化鋰-匹魯卡品注射后50-150分鐘之間,然后逐漸消退。間斷缺氧預(yù)處理-癲癇組平均改良Racine評分明顯低于其余兩組。而間斷缺氧預(yù)處理-抑制劑-癲癇組大鼠的發(fā)作表現(xiàn)與癲癇組大鼠基本相似。間斷缺氧預(yù)處理-癲癇組的全身性發(fā)作潛伏期和全身性發(fā)作百分比相比其余兩組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。免疫印跡分析表明與癲癇組相比,MCT4的表達在間斷缺氧預(yù)處理-癲癇組及間斷缺氧預(yù)處理-抑制劑-癲癇組均明顯上調(diào)(P0.05),而間斷缺氧預(yù)處理-癲癇組及間斷缺氧預(yù)處理-抑制劑-癲癇組之間無明顯區(qū)別(P0.05)。免疫熒光雙標(biāo)表明相比癲癇組,大鼠海馬CA1區(qū)MCT4的表達在間斷缺氧預(yù)處理-癲癇組及間斷缺氧預(yù)處理-CHC-癲癇組上調(diào)明顯。結(jié)論:CHC是乳酸和丙酮酸轉(zhuǎn)運的抑制劑,并不影響MCT4的表達。然而,乳酸轉(zhuǎn)運功能的干擾將阻斷IHP預(yù)處理所誘導(dǎo)的大鼠癲癇耐受的有效保護作用。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R742.1

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本文編號：2565401