【摘要】：癲癇性發(fā)作定義為“由于過(guò)度的同步化的大腦神經(jīng)元活動(dòng)而導(dǎo)致的一種短暫的征兆和/或征象。”一群神經(jīng)元突發(fā),暫時(shí)性同步化活動(dòng)的原因尚不明確。大量研究表明干擾腦的能量代謝與顳葉癲癇(Temporal lobe epilepsy,TLE)的病理生理相關(guān),而星形膠質(zhì)細(xì)胞最重要的功能就是維護(hù)大腦能量自穩(wěn)態(tài)。對(duì)這一狀況的更好地了解將提供給神經(jīng)科學(xué)家和內(nèi)科醫(yī)師關(guān)鍵性的信息從而使其能夠開(kāi)發(fā)出對(duì)患者有益的進(jìn)一步的治療措施。預(yù)處理指的是細(xì)胞,器官或者有機(jī)體暴露于亞致死的損傷而產(chǎn)生的對(duì)隨后嚴(yán)重?fù)p傷保護(hù)作用。接近且低于細(xì)胞損傷閾值的傷害性刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)從而保護(hù)器官抵抗進(jìn)一步的同種損傷(耐受)或者不同損傷(交叉耐受)刺激。盡管發(fā)現(xiàn)癲癇預(yù)處理,輕微的癲癇發(fā)作能夠保護(hù)神經(jīng)元抵抗后續(xù)癲癇持續(xù)狀態(tài)(Status epilepticus,SE),也能保護(hù)神經(jīng)元抵抗缺血。但很少有研究關(guān)注是否缺氧/缺血預(yù)處理也能夠?qū)ι窠?jīng)元提供保護(hù)作用而抗癲癇。缺血/缺氧時(shí),星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放的乳酸在能量危機(jī)時(shí)被神經(jīng)元吸收作為能量。主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)的單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-4(Monocarboxylate transporter 4,MCT4)的生理角色與這一過(guò)程密切相關(guān)。哺乳動(dòng)物體內(nèi)普遍表達(dá)的低氧誘導(dǎo)因子1α(Hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)是重要轉(zhuǎn)錄因子之一,其通過(guò)對(duì)缺血/缺氧的及時(shí)應(yīng)答以保持體內(nèi)氧平衡。缺血/缺氧信號(hào)刺激HIF-1α上調(diào),進(jìn)而調(diào)控多種下游靶基因,通過(guò)促進(jìn)紅細(xì)胞和血管新生,達(dá)到改善組織缺血/缺氧的目的。MCT4基因恰好是HIF-1α的眾多靶基因之一。本研究的目的在于證明以下假設(shè),缺氧預(yù)處理可以通過(guò)上調(diào)MCT4的表達(dá)為神經(jīng)元提供保護(hù)而起到抗癲癇作用。通過(guò)形態(tài)學(xué),分子生物學(xué)和行為學(xué)的方法比較了缺氧處理對(duì)培養(yǎng)原代大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞及間斷缺氧預(yù)處理(Intermittent hypoxia preconditioning,IHP)對(duì)氯化鋰-匹魯卡品癲癇模型大鼠的作用。結(jié)果表明缺氧會(huì)明顯上調(diào)原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的MCT4,間斷缺氧預(yù)處理5日可以為癲癇模型大鼠提供最強(qiáng)大的抗癲癇作用。這一保護(hù)作用在標(biāo)準(zhǔn)化間斷缺氧預(yù)處理后第3日最為明顯。本實(shí)驗(yàn)分為以下四個(gè)部分:第一部分:糖氧剝奪處理對(duì)離體培養(yǎng)原代大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞MCT4表達(dá)的影響目的:通過(guò)對(duì)SD大鼠原代海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的免疫印跡和免疫細(xì)胞化學(xué)分析,對(duì)比正�；蛉毖鯒l件下MCT4在星形膠質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá)情況。方法:培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組與缺氧組。缺氧組細(xì)胞進(jìn)行糖氧剝奪(Oxygen glucose deprivation,OGD)處理8h。恢復(fù)至正常培養(yǎng)條件下24小時(shí)后,培養(yǎng)皿中細(xì)胞收集進(jìn)行MCT4的免疫印跡檢測(cè),爬片上的細(xì)胞雙標(biāo)MCT4和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)。結(jié)果:免疫印跡及雙標(biāo)免疫熒光染色均表明,經(jīng)過(guò)8小時(shí)的OGD處理,缺氧組星形膠質(zhì)細(xì)胞的MCT4表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高(P0.05)。結(jié)論:缺氧處理可以明顯誘導(dǎo)培養(yǎng)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞上MCT4表達(dá)上調(diào)。第二部分:間斷缺氧預(yù)處理對(duì)大鼠海馬MCT4及HIF-1α表達(dá)的影響目的:通過(guò)對(duì)不同間斷缺氧預(yù)處理周期SD大鼠海馬MCT4、HIF-1α,GFAP及神經(jīng)元抗核抗體(neuronal nuclei,Neu N)的免疫印跡、雙標(biāo)免疫熒光及免疫組化分析,確定標(biāo)準(zhǔn)化大鼠間斷缺氧預(yù)處理周期。方法:36只大鼠被隨機(jī)均分對(duì)照組和5個(gè)間斷缺氧預(yù)處理組。間斷缺氧預(yù)處理組大鼠分別給予間斷缺氧預(yù)處理1d,3d,5d,7d和14d。預(yù)處理結(jié)束后24h,每組3只大鼠取海馬進(jìn)行MCT4和HIF-1α的免疫印跡檢測(cè),另3只大鼠取鼠腦免疫熒光雙標(biāo)MCT4、GFAP和Neu N。結(jié)果:免疫印跡分析表明IHP組HIF-1α表達(dá)峰值出現(xiàn)在IHP 3d時(shí)間點(diǎn),MCT4表達(dá)的峰值出現(xiàn)稍顯滯后在5d時(shí)間點(diǎn),隨后二者表達(dá)逐漸下降。相比對(duì)照組及IHP 14d組,HIF-1α表達(dá)在IHP 3d組升高最為明顯(P0.05),MCT4表達(dá)在IHP 5d組升高最為明顯(P0.05)。大鼠海馬CA1區(qū)MCT4的免疫熒光標(biāo)記與免疫印跡分析的變化趨勢(shì)一致。然而,海馬CA1區(qū)GFAP及顳葉皮層Neu N的免疫組化染色不會(huì)被IHP預(yù)處理所影響。結(jié)論:間斷缺氧預(yù)處理會(huì)明顯誘導(dǎo)海馬MCT4和HIF-1α上調(diào),但不會(huì)引起器質(zhì)性腦損傷。因此,間斷缺氧預(yù)處理5日被確認(rèn)為本研究中標(biāo)準(zhǔn)化的IHP預(yù)處理預(yù)處理周期。第三部分:間斷缺氧預(yù)處理對(duì)氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠癲癇易感性的影響目的:為了進(jìn)一步闡明癲癇易感性與大鼠海馬MCT4和HIF-1α表達(dá)變化之間的關(guān)系,對(duì)IHP預(yù)處理后癲癇模型大鼠進(jìn)行了電生理監(jiān)測(cè),行為學(xué)觀察,免疫印跡和雙標(biāo)免疫熒光分析。方法:99只大鼠隨機(jī)均分為9組:對(duì)照組,癲癇組(僅注射氯化鋰-匹魯卡品誘發(fā)癲癇),缺氧預(yù)處理組(僅僅進(jìn)行5天間斷缺氧預(yù)處理)和6個(gè)缺氧預(yù)處理-癲癇組。在標(biāo)準(zhǔn)間斷缺氧預(yù)處理后第1日(IHP-1d seizure組),第2日(IHP-2d seizure組),第3日(IHP-3d seizure組),第5日(IHP-5d seizure組),第7日(IHP-7d seizure組)和第14日(IHP-14d seizure組),各組分別注射氯化鋰-匹魯卡品誘發(fā)癲癇。誘發(fā)后,癲癇組及6個(gè)缺氧預(yù)處理-癲癇組的各3只大鼠進(jìn)行電生理監(jiān)測(cè)4小時(shí),另外8只進(jìn)行4小時(shí)行為學(xué)觀察。依據(jù)改良的Racine評(píng)分法每5min進(jìn)行一次發(fā)作行為學(xué)評(píng)分持續(xù)4小時(shí)。同時(shí)也記錄全身性發(fā)作達(dá)到4級(jí)的潛伏期和全身性發(fā)作百分比(評(píng)級(jí)為4和5級(jí)占所有評(píng)級(jí)時(shí)間點(diǎn)的百分比)。癲癇誘發(fā)后24小時(shí)海馬MCT4,HIF-1α和GFAP的表達(dá)是通過(guò)免疫印跡分析以及免疫熒光雙標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)的。結(jié)果:癲癇組大鼠的背景腦電顯示出全面強(qiáng)直陣攣性的癲癇樣異常包括多棘波異常和棘慢波放電。IHP-3d seizure組大鼠的背景腦電僅出現(xiàn)偶發(fā)性的癇樣放電。誘發(fā)癲癇的改良Racine評(píng)分平均峰值在氯化鋰-匹魯卡品注射后50-150分鐘之間,然后逐漸消退。IHP-3d seizure組大鼠的平均改良Racine評(píng)分明顯低于其余各組。IHP-3d seizure組大鼠的全身性發(fā)作潛伏期和全身性發(fā)作百分比相比癲癇組大鼠的參數(shù),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。免疫印跡分析表明與癲癇組相比,MCT4和HIF-1α的表達(dá)在單純IHP組,IHP-3d seizure組以及IHP-5d seizure組均明顯上調(diào)(P0.05)。免疫熒光雙標(biāo)表明相比癲癇組大鼠海馬齒狀回(hippocampal Dentate Gyrus,DG)MCT4的表達(dá)在IHP-3d seizure組上調(diào)最為明顯,而GFAP的表達(dá)并無(wú)變化。結(jié)論:標(biāo)準(zhǔn)化的IHP預(yù)處理可以通過(guò)上調(diào)海馬區(qū)MCT4和HIF-1α的表達(dá)而為大鼠提供最大的抗癲癇保護(hù)作用。癲癇耐受效果在IHP后第3日最為明顯。第四部分:乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能的干擾對(duì)IHP預(yù)處理所誘導(dǎo)的大鼠癲癇耐受的影響目的:為了進(jìn)一步闡明是否乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能的干擾將阻斷大鼠癲癇耐受的保護(hù)作用,對(duì)經(jīng)歷了不同處理的癲癇模型大鼠進(jìn)行了電生理監(jiān)測(cè),行為學(xué)觀察,免疫印跡和雙標(biāo)免疫熒光分析。方法:33只大鼠隨機(jī)均分為3組:癲癇組(僅注射氯化鋰-匹魯卡品誘發(fā)癲癇),間斷缺氧預(yù)處理-癲癇組(標(biāo)準(zhǔn)間斷缺氧預(yù)處理后72小時(shí),注射氯化鋰-匹魯卡品誘發(fā)癲癇)和間斷缺氧預(yù)處理-抑制劑-癲癇組(該組大鼠經(jīng)歷與缺氧預(yù)處理-癲癇組同樣的程序,只是在匹魯卡品注射前4小時(shí),腹腔注射α-氰基-4-羥基肉桂酸乙酯(CHC,90mg/kg,美國(guó)Sigma公司)這是一種特異性的線粒體乳酸和丙酮酸的共價(jià)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑)。誘發(fā)后,各組的3只大鼠進(jìn)行電生理監(jiān)測(cè)4小時(shí),另外8只進(jìn)行4小時(shí)行為學(xué)觀察。記錄與第三部分相同的行為學(xué)參數(shù)。癲癇誘發(fā)后24小時(shí)海馬MCT4,HIF-1α和GFAP的表達(dá)是通過(guò)免疫印跡分析以及免疫熒光雙標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)的。結(jié)果:間斷缺氧預(yù)處理-抑制劑-癲癇組大鼠的背景腦電同癲癇組一樣顯示出全面強(qiáng)直陣攣性的癲癇樣異常,而間斷缺氧預(yù)處理-癲癇組大鼠的背景腦電僅出現(xiàn)偶發(fā)性的癇樣放電。誘發(fā)癲癇的改良Racine評(píng)分平均峰值在氯化鋰-匹魯卡品注射后50-150分鐘之間,然后逐漸消退。間斷缺氧預(yù)處理-癲癇組平均改良Racine評(píng)分明顯低于其余兩組。而間斷缺氧預(yù)處理-抑制劑-癲癇組大鼠的發(fā)作表現(xiàn)與癲癇組大鼠基本相似。間斷缺氧預(yù)處理-癲癇組的全身性發(fā)作潛伏期和全身性發(fā)作百分比相比其余兩組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。免疫印跡分析表明與癲癇組相比,MCT4的表達(dá)在間斷缺氧預(yù)處理-癲癇組及間斷缺氧預(yù)處理-抑制劑-癲癇組均明顯上調(diào)(P0.05),而間斷缺氧預(yù)處理-癲癇組及間斷缺氧預(yù)處理-抑制劑-癲癇組之間無(wú)明顯區(qū)別(P0.05)。免疫熒光雙標(biāo)表明相比癲癇組,大鼠海馬CA1區(qū)MCT4的表達(dá)在間斷缺氧預(yù)處理-癲癇組及間斷缺氧預(yù)處理-CHC-癲癇組上調(diào)明顯。結(jié)論:CHC是乳酸和丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制劑,并不影響MCT4的表達(dá)。然而,乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能的干擾將阻斷IHP預(yù)處理所誘導(dǎo)的大鼠癲癇耐受的有效保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R742.1

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本文編號(hào)：2565401