【摘要】：研究背景及目的:吉蘭巴雷綜合征(Guillain-Barrésyndrome,GBS)是一種影響周圍神經(jīng)系統(tǒng)(peripheral nervous system,PNS)的自身免疫性疾病和急性炎癥性疾病,是目前世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的急性弛緩性癱瘓?jiān)蛑?是嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)突發(fā)事件的主要來(lái)源[1]。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎(experimental autoimmune neuritis,EAN)已經(jīng)作為GBS的經(jīng)典動(dòng)物模型被廣泛接受。巨噬細(xì)胞在炎性環(huán)境中有兩種模式,即具有促炎作用的M1模式,和具有抗炎作用的M2模式,他們之間可以互相轉(zhuǎn)化[2-3]。依維莫司(RAD001)屬于哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)抑制劑,作為強(qiáng)有力的免疫調(diào)節(jié)劑,已被用于治療癌癥和自身免疫性疾病[4-10]并且發(fā)揮了積極的作用。截至目前,許多抗炎、免疫調(diào)節(jié)劑及單克隆抗體均作為治療GBS的可能選擇而在EAN上試用,但有關(guān)RAD001對(duì)于GBS的調(diào)節(jié)及治療作用尚無(wú)報(bào)道。基于以往關(guān)于RAD001免疫調(diào)節(jié)作用的研究,我們假設(shè)RAD001對(duì)于EAN具有抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用,分別在EAN大鼠的免疫階段和發(fā)病階段應(yīng)用RAD001進(jìn)行藥物干預(yù),通過(guò)觀察EAN大鼠的臨床評(píng)分、病理變化、電生理指標(biāo)、M1/M2巨噬細(xì)胞表型的分布和炎性環(huán)境變化,來(lái)分析m TOR通路的抑制和Akt的激活對(duì)EAN的作用,進(jìn)而評(píng)價(jià)RAD001對(duì)EAN大鼠的治療作用,并探討其作用機(jī)制。研究方法:乳化P0180-199肽段后,誘導(dǎo)Lewis大鼠成模。將造模后的大鼠隨機(jī)分組,分為對(duì)照組,RAD001預(yù)防用藥組和治療用藥組。采用雙盲法觀察并評(píng)估大鼠每天的臨床癥狀。在疾病高峰期,即免疫后第16天,進(jìn)行坐骨神經(jīng)肌電圖檢測(cè)評(píng)估坐骨神經(jīng)電生理受損情況,指標(biāo)包括誘發(fā)復(fù)合肌肉動(dòng)作電位(compound muscle action potential,CMAP)波幅、潛伏期和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(motor nerve conduction velocity,MNCV)。在疾病高峰期,對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)進(jìn)行取材,準(zhǔn)備進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)評(píng)估炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和脫髓鞘情況,并進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)分析巨噬細(xì)胞分化情況;同時(shí)提取坐骨神經(jīng)總蛋白,進(jìn)行蛋白印跡分析,探討m TOR通路蛋白變化情況。在疾病高峰期,對(duì)大鼠脾臟取材,提取單個(gè)核細(xì)胞,分析淋巴細(xì)胞增殖情況,采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)炎性細(xì)胞因子表達(dá)情況及應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞分化情況。應(yīng)用Graph Pad Prism 5.0軟件對(duì)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,p0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果:1.與對(duì)照組相比,兩個(gè)RAD001治療組均可改善EAN大鼠高峰期的臨床癥狀,預(yù)防組可延遲EAN大鼠的發(fā)病時(shí)間。RAD001治療可以減輕EAN引起的周圍神經(jīng)損傷。與對(duì)照組相比,RAD001預(yù)防組和治療組炎性細(xì)胞數(shù)量減少,髓鞘脫失程度減輕(p0.05)。神經(jīng)電生理檢測(cè)表明,控制組MNCV明顯減慢,兩個(gè)治療組CMAP明顯升高,潛伏期顯著縮短。2.Western印跡分析RAD001對(duì)于EAN大鼠坐骨神經(jīng)中p-P70S6K、p-4E-BP1和p-Akt的作用,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,RAD001預(yù)防組和治療組中EAN大鼠坐骨神經(jīng)切片中p-Akt表達(dá)增加,p-4E-BP1和p-P70S6K表達(dá)減少(p0.05)。3.P0180-199刺激后,相對(duì)于對(duì)照組的OD值(2.35±0.34),在預(yù)防組(0.98±0.16),和治療組(0.73±0.18)的淋巴細(xì)胞增殖均可被抑制,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。對(duì)于沒(méi)有P0180-199的刺激,三個(gè)組之間也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。說(shuō)明RAD001抑制淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。4.坐骨神經(jīng)免疫熒光結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,RAD001預(yù)防組和治療組均顯示M2巨噬細(xì)胞表型表達(dá)升高,M1巨噬細(xì)胞表型表達(dá)降低(p0.05)。脾單個(gè)核細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)分析表明,RAD001預(yù)防組和治療組M2巨噬細(xì)胞水平較對(duì)照組有明顯升高(p0.05)。說(shuō)明RAD001促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞極化。5.RAD001對(duì)細(xì)胞因子的影響:與對(duì)照組相比,一些促炎癥因子(IL-1α、IFN-γ、RANTES和IL-17)在蛋白和/或m RNA水平上在RAD001預(yù)防組和治療組表達(dá)量明顯降低,而抗炎細(xì)胞因子(IL-10、TGF-β和IL-4)在蛋白和/或m RNA水平上含量顯著增加(p0.05)。但三組中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL 12、IL-13、TNF-α或GM-CSF沒(méi)有顯著區(qū)別。研究結(jié)論:我們的研究表明,RAD001通過(guò)抑制m TOR通路,抑制下游產(chǎn)物,導(dǎo)致p-Akt水平升高,從而造成巨噬細(xì)胞向M2型分化增加,緩解EAN癥狀。RAD001在ENA鼠的抗炎效應(yīng),可能與人類GBS相似,可以改善炎性環(huán)境,間接起到神經(jīng)保護(hù)作用。因此,RAD001可能是緩解多發(fā)性周圍神經(jīng)病的一個(gè)候選藥物。
【圖文】：

31圖 1、自身免疫性神經(jīng)炎大鼠的臨床評(píng)分和自身免疫性神經(jīng)炎大鼠坐骨神經(jīng)的組織病理學(xué)檢測(cè)Fig 1. Clinical score and histopathological analysis of sciatic nerves of EAN ratsRAD001 治療組與對(duì)照組比較使用 Mann-Whitney U tests 完成。在 D 和 F 中比例尺是 10μm。(A) 在 RAD001 預(yù)防組和 RAD001 治療組，大鼠從免疫后 7到16天的臨床評(píng)分和10到16 天的臨床評(píng)分顯示明顯好于對(duì)照組(每組在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別比較， p < 0.05)。RAD001 預(yù)防組、RAD001 治療組和對(duì)照組臨床評(píng)分的平均峰值分別為 3.20±0.58,3.50±0.22,6.90±0.29(圖 1A 和 B), 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, p < 0.05。很顯然，，在預(yù)防治療組,第一次臨床癥狀的出現(xiàn)被推遲到9.20±0.20天(圖 1A 和 C),而這種跡象很快出現(xiàn)在治療組（免疫后 7.20±0.20 天）和對(duì)照組（免疫后 6.80±0.20 天）(圖 1 C)。(B-C) RAD001 改善了臨床評(píng)分的峰值，延遲自身免疫性神經(jīng)炎大鼠疾病發(fā)作的時(shí)間。免疫后第 16 天, 我們?cè)u(píng)估了自身免疫性神經(jīng)炎大鼠在臨床發(fā)病高峰期坐骨神經(jīng)的組織病理學(xué)情況。HE 染色(D)用于顯

圖 2、RAD001 減輕了 EAN 引起的周圍神經(jīng)損傷Figure 2. RAD001 improves peripheral nerve conduction deficits in EAN rats.自身免疫性神經(jīng)炎大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)CMAPs典型的電生理記錄是刺激坐骨神經(jīng)的腓骨頭(A)或踝關(guān)節(jié)(B)誘發(fā)出來(lái)的，從左至右分別表示的是控制組、依維莫司預(yù)防組和治療組。與對(duì)照組比較,RAD001 用藥組免受自身免疫性神經(jīng)炎引起的平均運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(MNCV)的減慢(C)。與對(duì)照組相比，RAD001 用藥組改善了CMAPs(D)的振幅，同時(shí)也表現(xiàn)出更好的CMAPs的遠(yuǎn)端運(yùn)動(dòng)潛伏時(shí) (E)。對(duì)照組和 RAD001 治療組用 Mann-Whitney U 檢驗(yàn)比較，數(shù)據(jù)用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示(依維莫司治療組與控制組比較，* p < 0.05;每組 n = 4 )。相似的結(jié)果實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。RAD001-P, preventive RAD001 group; RAD001-T, therapeutic RAD001group。2.3 依維莫司抑制淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)在免疫后第 16 天，無(wú)菌條件下取脾臟并提取單個(gè)核細(xì)胞制成懸液，用P0180-199或無(wú)抗原刺激 72 小時(shí)后，應(yīng)用 MTS 方法評(píng)估 RAD001 對(duì)于 T 細(xì)胞增殖
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R745.43

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本文編號(hào)：2561649