【摘要】：研究背景： 小膠質(zhì)細胞是存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的免疫細胞，其持續(xù)激活可引起腦內(nèi)的慢性神經(jīng)炎癥反應(yīng)，并導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素（Glucocoticoids，GCs）介導(dǎo)的體液抗炎通路在腦內(nèi)炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，小膠質(zhì)細胞上可高表達糖皮質(zhì)激素受體（Glucocoticoid receptor，GR），是GCs的直接抗炎靶標(biāo)。α7煙堿型乙酰膽堿受體（alpha7nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR）作為一種新的炎癥調(diào)節(jié)機制——膽堿能神經(jīng)抗炎通路（Cholinergic anti-inflammatory pathway，CAP）的關(guān)鍵分子，亦大量表達于小膠質(zhì)細胞。研究顯示小膠質(zhì)細胞α7nAChR與神經(jīng)炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，激動α7nAChR可以抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)，表明小膠質(zhì)細胞α7nAChR介導(dǎo)的抗炎作用是機體調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥反應(yīng)的另一重要機制。作為機體內(nèi)兩條重要的內(nèi)源性抗炎通路，生理濃度GCs與CAP通路在腦內(nèi)炎癥調(diào)節(jié)中的關(guān)系如何，兩者之間是否存在關(guān)聯(lián)，對該類問題的研究尚未有報道。小膠質(zhì)細胞上同時表達GR和α7nAChR，可作為體液和CAP通路的共同抗炎靶標(biāo)，且對神經(jīng)元的研究表明，GCs可以調(diào)節(jié)α7nAChR表達。這些證據(jù)均提示GCs可能通過CAP通路調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞引起的炎癥反應(yīng)。因此，本研究擬利用小膠質(zhì)細胞探討GCs介導(dǎo)的體液抗炎通路與α7nAChR介導(dǎo)的CAP通路之間的關(guān)系，進一步揭示腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)機制。 目的： 探討小膠質(zhì)細胞α7nAChR在生理濃度糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中的作用，揭示體液與膽堿能抗炎通路之間的關(guān)系，并初步闡明其調(diào)節(jié)機制。 方法： 本實驗藥物選用糖皮質(zhì)激素類中的氫化可的松（Hydrocortisone，Hydr），其生理濃度范圍為110-520nM。MTT法檢測不同濃度Hydr對bv-2小膠質(zhì)細胞活性的影響，脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激bv-2小膠質(zhì)細胞造成炎癥模型。在建立炎癥模型的基礎(chǔ)上，分為空白對照組、LPS組、Hydr＋LPS組，ELISA方法檢測炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β釋放水平，觀察高濃度和生理濃度Hydr對其的影響；其次，加入α7nAChR拮抗劑甲基牛扁亭堿（Methyllycaconitine，MLA），分為空白對照組、LPS組、Hydr（300nM）＋LPS組、MLA(10nM)+Hydr（300nM）+LPS組，使用ELISA方法檢測炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β釋放水平，并觀察小膠質(zhì)細胞形態(tài)學(xué)的變化情況，以探索生理濃度Hydr是否通過α7nAChR在抗炎中起作用；最后，分為空白對照組、Hydr組、MLA+Hydr組，采用RT-PCR檢測Hydr對α7nAChR、GR mRNA表達的影響，Western blot檢測Hydr對α7nAChR蛋白質(zhì)水平的影響，探討體液抗炎與膽堿能抗炎之間的聯(lián)系。 結(jié)果： 1.生理濃度的糖皮質(zhì)激素對LPS誘致炎癥反應(yīng)的抑制作用： (1) MTT結(jié)果顯示，與空白組相比，2000nM Hydr可使細胞活性顯著降低（P0.01），1000nM、500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM的Hydr對細胞活性無明顯影響。 (2)經(jīng)LPS刺激，bv-2細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β的含量隨著刺激濃度的增加和刺激時間的延長逐漸遞增，呈現(xiàn)時間和劑量依賴性的關(guān)系；經(jīng)不同濃度的Hydr給藥預(yù)作用后，生理濃度范圍（110-520nM）內(nèi)Hydr(500,250nM)可顯著降低TNF-α、IL-1β的生成量（P 0.01，P 0.05）。 2. α7nAChR在介導(dǎo)生理濃度的糖皮質(zhì)激素抑制炎癥反應(yīng)中的作用： (1) Hydr (300nM)可顯著降低TNF-α、IL-1β的生成量（P 0.01），這一作用可被α7nAChR特異性拮抗劑MLA（10nM）拮抗（P 0.01，P 0.05）。 (2) Hydr (300nM)可顯著抑制小膠質(zhì)細胞bv-2的激活，減少細胞分枝和偽足的生成，而這一作用同樣可被α7nAChR特異性拮抗劑MLA（10nM）拮抗。 3.生理濃度的糖皮質(zhì)激素對α7nAChR和GR受體的調(diào)控情況： (1) Hydr (300nM)可增加bv-2細胞α7nAChR mRNA表達，這一作用同樣可被MLA（10nM）拮抗。 (2) Hydr (300nM)可增加bv-2細胞GR mRNA表達。MLA（10nM）對這一作用無拮抗。 (3) Hydr (300nM)可增加bv-2細胞α7nAChR蛋白表達，，并被MLA（10nM）拮抗。 結(jié)論 1.生理濃度糖皮質(zhì)激素可以抑制小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)； 2. α7nAChR參與了生理濃度糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的抗炎作用； 3.生理濃度糖皮質(zhì)激素通過上調(diào)α7nAChR表達參與了CAP通路，與體液抗炎通路共同調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。
【圖文】：

3圖1 小膠質(zhì)細胞的激活示意圖（根據(jù)Hanisch和Kettenmann的研究[35])2 糖皮質(zhì)激素對神經(jīng)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素（Glucocorticoid , GCs）是腎上腺皮質(zhì)分泌的具有廣泛生理效應(yīng)的激素，臨床上多用于治療各種炎性疾病。糖皮質(zhì)激素主要與糖皮質(zhì)激素受體（Glucocorticoid receptor，GR）結(jié)合而發(fā)揮藥理作用。作為機體重要的內(nèi)源性抗炎系統(tǒng)，腦內(nèi)的糖皮質(zhì)激素也起到了重要的調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥反應(yīng)作用。糖皮質(zhì)激素可拮抗多種炎癥因子如細胞因子、黏附分子、酶以及受體的蛋白表達，還能通過上調(diào)一些抗炎物質(zhì)在細胞內(nèi)的表達而進一步發(fā)揮抗炎作用[36]。分子生物學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素可顯著抑制體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞激活，減

圖 2 CAP 對神經(jīng)炎癥的調(diào)節(jié)機制示意圖[67] α7nAChR 的調(diào)節(jié)，糖皮質(zhì)激素治療可以選擇性降低N受體拮抗劑α-BT皮質(zhì)激素可與N受體結(jié)合[68]，并可調(diào)控α7nAChR的表研究中發(fā)現(xiàn)，α7nAChR基因CHRNA7的近端啟動子序件，點突變表明其參與了α7nAChR的基因調(diào)節(jié)[69]。隨過與早期生長反應(yīng)因子（Egr-1）基因的結(jié)合，增強[70]。此外，在海馬CA1、CA3區(qū)和齒狀回，內(nèi)源性糖R的mRNA的表達[71]。由此提示，糖皮質(zhì)激素可能通過炎作用。小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)退
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R741

【參考文獻】

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本文編號：2556905