發(fā)布時(shí)間：2019-11-02 10:30

【摘要】：既往研究認(rèn)為,中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)是免疫豁免區(qū),正常生理情況下的成年動(dòng)物CNS不表達(dá)MHC Ⅰ類(lèi)分子或表達(dá)量極低,近年來(lái)研究表明CNS感染及損傷刺激能夠誘導(dǎo)MHC Ⅰ類(lèi)分子的表達(dá),且該分子與腦組織的二次損傷和修復(fù)過(guò)程密切相關(guān)。研究已經(jīng)證實(shí)小鼠缺血性腦卒中7天后MHC Ⅰ類(lèi)分子表達(dá)增強(qiáng)。作為世界范圍內(nèi)致死致殘率最高的疾病之一,提高對(duì)腦卒中的診斷與治療水平,降低腦卒中的致殘率和死亡率是當(dāng)務(wù)之急。缺血半暗帶的存在是急性缺血性腦卒中血管再通以及血管神經(jīng)保護(hù)治療的理論基礎(chǔ)和關(guān)鍵靶點(diǎn)。而缺血性腦卒中急性期MHC Ⅰ類(lèi)分子的時(shí)空特異性表達(dá)情況,以及MHC Ⅰ類(lèi)分子是否能夠用作腦缺血成像分子靶標(biāo)的研究未見(jiàn)報(bào)道。這兩項(xiàng)研究不僅對(duì)進(jìn)一步了解該分子參與缺血缺氧性腦損傷及修復(fù)的機(jī)制有重要意義,也對(duì)缺血性腦卒中的靶向性成像具有重要應(yīng)用價(jià)值。本研究首先在小鼠腦缺血性卒中模型及體外神經(jīng)元缺氧缺糖模型中檢測(cè)了MHC Ⅰ類(lèi)分子表達(dá)變化：接著利用生物信息學(xué)方法篩選能與小鼠MHC Ⅰ類(lèi)分子H-2K~b、H-2D~b均能高親和結(jié)合的肽；驗(yàn)證該肽的特異性及親和性后,利用體外神經(jīng)元OGD模型探索修飾肽的結(jié)合模式；在小鼠腦缺血卒中模型中以MHC Ⅰ類(lèi)分子靶向性探針進(jìn)行活體成像,獲得如下結(jié)果：1、在小鼠MCAO卒中模型中,缺血6小時(shí)、24小時(shí)缺血側(cè)腦組織MHC Ⅰ類(lèi)分子顯著強(qiáng)于對(duì)側(cè)腦組織：在小鼠光化學(xué)法誘導(dǎo)皮層缺血卒中模型中,我們發(fā)現(xiàn)3小時(shí)組MHC Ⅰ類(lèi)分子表達(dá)量最高,在24小時(shí)內(nèi)隨著時(shí)間點(diǎn)的推移,上調(diào)表達(dá)幅度逐漸降低。且發(fā)現(xiàn)在兩種缺血卒中模型檢測(cè)的各時(shí)間點(diǎn),Western blot檢測(cè)缺血側(cè)MHC Ⅰ類(lèi)分子表達(dá)量均高于對(duì)側(cè),MHC Ⅰ類(lèi)分子的55KDa條帶差異比45KDa更顯著。原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元OGD模型發(fā)現(xiàn)MHC Ⅰ類(lèi)分子在缺氧2小時(shí)或4小時(shí)后,在復(fù)氧24小時(shí)內(nèi),隨著復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng),表達(dá)量逐漸升高。以上結(jié)果提示體內(nèi)及體外缺氧模型中誘導(dǎo)表達(dá)MHC Ⅰ類(lèi)分子的機(jī)制可能不一致。MHC Ⅰ類(lèi)分子在缺血性腦卒中發(fā)病后超急性期(發(fā)病6小時(shí)內(nèi))顯著上調(diào)表達(dá)的模式,提示該分子可以作為缺血性腦卒中早期成像的潛力靶標(biāo)。2、生物信息學(xué)方法篩選獲得小鼠H-2K~b/H-2D~b靶向多肽--H2BP,以人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)方法預(yù)測(cè)H2BP與H-2K~b的親和力為51nM,與H-2D~b的親和力為3nM。H2BP-MHC Ⅰ復(fù)合體/gp33-MHC Ⅰ復(fù)合體與CNS可能配體Ly49A分子對(duì)接及打分后,預(yù)測(cè)H2BP-MHC Ⅰ復(fù)合體、gp33-MHC Ⅰ復(fù)合體分別引起的Ly49A通路活化狀況可能與外周免疫系統(tǒng)TCR通路的情況類(lèi)似,即H2BP-MHC Ⅰ對(duì)Ly49A分子的親和力低于gp33-MHC Ⅰ復(fù)合體。以上結(jié)果提示H2BP肽能夠與MHC Ⅰ類(lèi)分子發(fā)生緊密結(jié)合；且在H2BP肽-MHC Ⅰ復(fù)合體與CNS受體相互作用中,MHC Ⅰ類(lèi)分子抗原結(jié)合槽內(nèi)的H2BP肽可能具有重要的影響。3、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,FITC-H2BP與兩種品系小鼠來(lái)源的脾細(xì)胞結(jié)合百分比差異明顯,C57BL/6脾細(xì)胞陽(yáng)性率明顯高于Babl/c脾細(xì)胞,說(shuō)明本研究所用FITC-H2BP能夠較好的區(qū)分H-2K~b、H-2D~b分子與H-2Kd、H-2Dd分子。進(jìn)一步以H-2K~b-/-D~b-/-小鼠與C57BL/6野生型小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn),FITC-H2BP肽在兩組小鼠的流式檢測(cè)中也存在明顯差異,而FITC-control peptide則不能體現(xiàn)出組間差別。OGD模型成像結(jié)果證明,FITC-H2BP肽與Tuj1標(biāo)記的神經(jīng)元結(jié)合能力明顯強(qiáng)于FITC-control peptide組,說(shuō)明缺氧誘導(dǎo)神經(jīng)元表達(dá)的MHC Ⅰ類(lèi)分子具有抗原遞呈功能,且FITC-H2BP肽能夠以競(jìng)爭(zhēng)低親和及中等親和表位肽的形式與神經(jīng)元表面誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的MHC Ⅰ類(lèi)分子特異性結(jié)合。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證明Cy5.5-H2BP近紅外熒光成像分子探針對(duì)神經(jīng)元毒性低,說(shuō)明Cy5.5-H2BP近紅外熒光成像分子探針能夠用于缺血性腦卒中模型小鼠的活體成像研究。4、在小鼠光化學(xué)法誘導(dǎo)皮層缺血卒中模型的活體成像研究中,結(jié)果顯示FITC-H2BP探針在小鼠缺血側(cè)半腦有明顯強(qiáng)于對(duì)側(cè)半腦的信號(hào)分布。Cy5.5-H2BP探針在腦缺血性卒中模型小鼠活體近紅外熒光信號(hào)分布結(jié)果顯示,探針尾靜脈注射5小時(shí)后,Cy5.5-H2BP分子探針在缺血側(cè)半腦有明顯強(qiáng)于對(duì)側(cè)半腦的信號(hào)分布,而對(duì)照探針Cy5.5-Control組在缺血側(cè)/對(duì)側(cè)未見(jiàn)明顯的熒光信號(hào)差異。離體腦組織及心肺等主要臟器組織近紅外熒光信號(hào)檢測(cè)的結(jié)果表明,與對(duì)照探針Cy5.5-Control相比,Cy5.5-H2BP不僅在腦組織具有更強(qiáng)的熒光信號(hào),同時(shí)腦組織熒光信號(hào)強(qiáng)度遠(yuǎn)高于心、肝、肺組織的熒光信號(hào)強(qiáng)度,進(jìn)一步說(shuō)明Cy5.5-H2BP近紅外熒光成像分子探針在腦缺血小鼠體內(nèi)具有良好的缺血腦組織靶向性。5、神經(jīng)元OGD誘導(dǎo)TLR4分子主要表達(dá)于神經(jīng)元胞體及樹(shù)突；MD2MP肽能夠特異性結(jié)合小鼠細(xì)胞表面的TLR4分子,對(duì)于LPS或OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元TLR4通路活化MD2MP肽均有靶向抑制效應(yīng)；在OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷中,MD2MP有明顯的挽救作用,并且MD2MP肽對(duì)缺血性腦卒中小鼠也有較理想的治療效果。以上結(jié)果表明MHC Ⅰ類(lèi)分子能夠作為缺血性腦卒中急性期成像的分子靶標(biāo),Cy5.5-H2BP分子探針能夠用于小鼠腦缺血性卒中模型活體近紅外成像,MD2MP肽能夠?qū)θ毖跞毖該p傷的神經(jīng)元提供神經(jīng)保護(hù)作用。我們的研究將為進(jìn)一步研究和證明MHC Ⅰ類(lèi)分子在腦缺血病理?yè)p傷和組織修復(fù)的機(jī)制以及腦卒中病情發(fā)展與治療效果的可視化奠定一定的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖２－２線(xiàn)栓法小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞（ＭＣＡＯ）卒中模型缺血后再灌注６小時(shí)，ＭＨＣ邋Ｉ類(lèi)分逡逑子表達(dá)模式。Ａ．ＭＨＣＩ類(lèi)分子在缺化側(cè)（Ｒ）義對(duì)側(cè)（Ｌ）半腦均有表達(dá)，缺化側(cè)皮層、紋逡逑狀體部位細(xì)胞的ＭＨＣＩ類(lèi)分子表達(dá)景均強(qiáng)于對(duì)側(cè)同一部位細(xì)胞，標(biāo)尺長(zhǎng)度表術(shù)ｌＯＯｕｍ。Ｂ．逡逑ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測(cè)ＭＨＣ邋Ｉ類(lèi)分子在缺血側(cè)（Ｒ）及對(duì)側(cè)（Ｌ）半腦各部位的表達(dá)情況（ｎ＝４）。逡逑缺血再灌注２４小時(shí)后，組織免疫巧光染色發(fā)現(xiàn)，ＭＨＣ邋Ｉ類(lèi)分子在大腦左右逡逑側(cè)半腦均有表達(dá)，但缺血側(cè)皮層部位細(xì)胞表達(dá)百分比均高于對(duì)側(cè)腦同一部位細(xì)逡逑胞。定量檢測(cè)缺血后再灌注２４小時(shí)腦組織各部分的ＭＨＣ邋Ｉ類(lèi)分子表達(dá)情況，逡逑我們根據(jù)６小時(shí)的表達(dá)變化，對(duì)２４小時(shí)腦組織蛋白僅按照缺血側(cè)（Ｒ）及對(duì)側(cè)逡逑（Ｌ）半腦區(qū)分進(jìn)行檢測(cè)，Ｗ小鼠來(lái)源單克隆抗體ＯＸ－１８同樣檢測(cè)到４５ＫＤａ與逡逑５５ＫＤａ兩條特異性帶，缺血側(cè)比對(duì)側(cè)半腦ＭＨＣＩ類(lèi)分子表達(dá)量顯著升高，且缺逡逑血側(cè)半腦比對(duì)側(cè)半腦條帶差異主要在５５ＫＤａ處，與６小時(shí)的檢測(cè)結(jié)果一致。逡逑

—邐廣？幽邋一邋，４３逡逑圖２－２線(xiàn)栓法小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞（ＭＣＡＯ）卒中模型缺血后再灌注６小時(shí)，ＭＨＣ邋Ｉ類(lèi)分逡逑子表達(dá)模式。Ａ．ＭＨＣＩ類(lèi)分子在缺化側(cè)（Ｒ）義對(duì)側(cè)（Ｌ）半腦均有表達(dá)，缺化側(cè)皮層、紋逡逑狀體部位細(xì)胞的ＭＨＣＩ類(lèi)分子表達(dá)景均強(qiáng)于對(duì)側(cè)同一部位細(xì)胞，標(biāo)尺長(zhǎng)度表術(shù)ｌＯＯｕｍ。Ｂ．逡逑ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測(cè)ＭＨＣ邋Ｉ類(lèi)分子在缺血側(cè)（Ｒ）及對(duì)側(cè)（Ｌ）半腦各部位的表達(dá)情況（ｎ＝４）。逡逑缺血再灌注２４小時(shí)后，組織免疫巧光染色發(fā)現(xiàn)，ＭＨＣ邋Ｉ類(lèi)分子在大腦左右逡逑側(cè)半腦均有表達(dá)，但缺血側(cè)皮層部位細(xì)胞表達(dá)百分比均高于對(duì)側(cè)腦同一部位細(xì)逡逑胞。定量檢測(cè)缺血后再灌注２４小時(shí)腦組織各部分的ＭＨＣ邋Ｉ類(lèi)分子表達(dá)情況，逡逑我們根據(jù)６小時(shí)的表達(dá)變化，，對(duì)２４小時(shí)腦組織蛋白僅按照缺血側(cè)（Ｒ）及對(duì)側(cè)逡逑（Ｌ）半腦區(qū)分進(jìn)行檢測(cè)，Ｗ小鼠來(lái)源單克隆抗體ＯＸ－１８同樣檢測(cè)到４５ＫＤａ與逡逑５５ＫＤａ兩條特異性帶
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R743.3

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本文編號(hào)：2554447