【摘要】：背景：硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)是種存在于真核生物和原核生物中的小分子蛋白，擁有多種生物學(xué)功能。在Trx的多種成員中，Trx1被研究得最廣泛。研究表明Trx1具有抗凋亡、抗氧化、抗腫瘤和抗炎等作用。近年來發(fā)現(xiàn)Trx1可以明顯減小腦缺血再灌注損傷大鼠的腦梗死體積和改善大鼠的神經(jīng)功能癥狀，在腦缺血再灌注損傷疾病防治方面具有很好的運用前景。 目的：探討Trx1對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及其相關(guān)的保護機制。 方法：運用改良Longa線栓法建立大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。將實驗動物隨機分為假手術(shù)組(sham)、缺血再灌注損傷組(MCAO)、MCAO+非特異性siRN（AControl siRNA）和3條特異性siRN（ATrx1siRNA1、Trx1siRNA2、Trx1siRNA3）處理組。處理組于MCAO模型前24h采用左側(cè)側(cè)腦室注射。觀察Trx1是否具有神經(jīng)保護作用并探討其相關(guān)的可能機制：（1）大鼠腦缺血1h再灌注24h后，將大鼠斷頭處死并取腦組織蛋白。利用Western blot蛋白印跡及Quantitative PCR法檢測Trx1蛋白及mRNA國家自然科學(xué)基金資助(No.81171090)在大鼠腦組織中的表達，篩選出高效的Trx1干擾序列。（2）對Sham組、MCAO組、MCAO+Control siRNA和MCAO+Trx1siRNA組大鼠進行死亡率的評估和神經(jīng)功能評分；應(yīng)用TTC染色法評估腦梗死體積；采用HE及尼氏染色法進行組織學(xué)觀察；TUNEL法檢測神經(jīng)元凋亡。（3）采用免疫共沉淀法（Co-IP）檢測Trx1-ASK1的結(jié)合情況。Western Blot測定ASK1、P-ASK1、JNK、P-JNK、p38、P-p38、cytochrome c和cleavedcaspase-3蛋白的表達。 結(jié)果：（1）與非特異性的Control siRNA組相比，，3條針對Trx1的siRNA均明顯抑制Trx1mRNA及蛋白質(zhì)的表達，而siRNA2對Trx1的抑制作用最強，其干擾效率達50%以上。 （2）Trx1siRNA能明顯增加腦缺血再灌注損傷后大鼠的死亡率、神經(jīng)功能評分、腦梗死體積和神經(jīng)元的凋亡率和死亡率。 （3）Trx1siRNA能顯著增加Trx1-ASK1的分離，增強P-ASK1、P-JNK、P-p38、cytochrome c和cleaved caspase-3凋亡相關(guān)蛋白的表達水平。 結(jié)論：（1）siRNA能特異性抑制體內(nèi)Trx1基因的表達，Trx1siRNA處理會加重大鼠腦缺血再灌注損傷。 （2）Trx1的腦神經(jīng)保護作用可能通過抗凋亡實現(xiàn)，而抑制凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）及其介導(dǎo)的下游信號通路JNK/P38可能是其實現(xiàn)神經(jīng)保護作用的重要機制之。
【圖文】：

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文采用 SPSS19.0 軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（ X ±S）表示，組間比較采用單因素方差(one-way ANOVA)結(jié)合 Post Hoc 檢驗分析，p<0.05 認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。3 結(jié)果3.1 Quantitative PCR 對 Trx1 最佳干擾序列的篩選qPCR 檢測 Trx1 mRNA 在大鼠腦組織中的表達（圖 1），以篩選出高效干擾大鼠Trx1 基因的 siRNA。與 sham 組相比，MCAO 和 control siRNA 組中 Trx1 mRNA 明顯升高(P<0.05）。而與陰性對照組相比，3條針對Trx1的siRNA 均明顯抑制Trx1 mRNA的表達，而 siRNA2 對 Trx1 的抑制作用最強，其干擾效率達 50%以上。2.7 統(tǒng)計分析

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文3.2 Western blot 對高效 Trx1 siRNA 序列的篩選Western blot 檢測 Trx1 蛋白在大鼠腦組織中的表達（圖 2），以篩選出高干擾大鼠 Trx1 基因的 siRNA。與 sham 組相比，MCAO 和 control siRNA 組中 Trx1白明顯增加(P<0.05）。而與陰性對照組相比，3 條針對 Trx1 的 siRNA 均明顯抑Trx1 蛋白的表達，同樣 siRNA2 對 Trx1 的抑制作用最強，其干擾效率達 50%以Western blot 和 RT-qPCR 篩選結(jié)果 致。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R743.3

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 袁婺洲,Bodmer R,朱傳炳,王躍群,李永清,吳秀山;利用RNAi技術(shù)研究果蠅心臟發(fā)育基因的功能[J];遺傳學(xué)報;2002年01期

本文編號：2553272