【摘要】：目的 探究1,1-Dimethyl-4-phenyl piperazine iodide（DMPP）抑制人腦惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細胞在雞胚絨毛尿囊膜上生長的原因，以及DMPP對雞胚早期血島的形成、卵黃囊膜血管的發(fā)生、絨毛尿囊膜血管的發(fā)生和對血管相關(guān)生長因子的影響，初步闡明DMPP抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤血管發(fā)生的作用機制。 方法 雞胚絨毛尿囊膜移植瘤模型：廣泛地用于探究腫瘤組織和血管生成相關(guān)的作用，利用此模型觀察DMPP對神經(jīng)膠質(zhì)瘤在雞胚絨毛尿囊膜上移植瘤形成和血管發(fā)生的影響。 Hematoxylin-eosin staining（HE染色）：組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài)染色。 細胞體外培養(yǎng)：將人腦惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系U87細胞進行體外培養(yǎng)用于移植。 5-Bromo-2-deoxyUridine（BrdU）標(biāo)記增殖細胞：可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活體注射或細胞培養(yǎng)加入，而后利用抗Brdu單克隆抗體，免疫組織化學(xué)反應(yīng)顯色或熒光二抗標(biāo)記，顯示增殖細胞。 （3-4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）MTT：細胞增殖及細胞活性的測定。 Western blotting蛋白免疫印跡：將DMPP處理后U87細胞提取的蛋白樣本通過聚丙烯酰胺電泳按分子量大小分離，再轉(zhuǎn)移到雜交膜（blot）上，然后通過凋亡相關(guān)的一抗，以及二抗復(fù)合物對蛋白樣本進行特異性檢測。 流式細胞儀檢測細胞凋亡（PI單染色法）：檢測DMPP處理后U87細胞的凋亡情況。 Masson染色：觀察移植瘤組織中纖維的染色，并區(qū)分組織中的血管和血細胞。 免疫熒光：利用FITC結(jié)合的SNA-1凝集素，標(biāo)記血管內(nèi)皮細胞。 整體胚胎原位雜交：利用分子生物學(xué)手段，合成VE-cadherin RNA探針，用于檢測胚胎內(nèi)源性VE-cadherin的表達。 雞胚卵黃囊膜模型：雞胚卵黃囊膜是一個胚體外的結(jié)構(gòu)，為胚胎發(fā)育提供營養(yǎng)，也是血管和成血管細胞聚集和發(fā)育的最早結(jié)構(gòu)位點，用于探究藥物對血管生成影響的良好模型。 （Reverse transcription-PCR）RT-PCR：將DMPP處理后的雞胚尿囊膜組織裂解后提取RNA，進行RT-PCR分析血管生成相關(guān)因子的表達情況。 結(jié)果 DMPP能顯著抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤在雞胚絨毛尿囊膜上的生長。我們將U87神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞進行體外培養(yǎng)，加入DMPP后運用MTT、BudU和流式細胞儀檢測相應(yīng)的細胞活性、增殖和凋亡，發(fā)現(xiàn)DMPP并不會顯著地影響U87細胞的增殖和存活。因此，我們運用了三種在體的血管發(fā)育和血管生成模型來仔細分析DMPP對血管發(fā)生的影響，包括早期雞胚血島模型，雞胚卵黃囊膜模型和雞胚絨毛尿囊膜模型，，發(fā)現(xiàn)DMPP直接抑制胚胎發(fā)育不同階段的血管生成。我們運用RT-PCR分析DMPP處理后的雞胚尿囊膜血管生成因子的表達情況，發(fā)現(xiàn)DMPP下調(diào)了（Angiopoietin-1）Ang-1和（Hypoxia-inducible factor）HIF-2α信號的表達。 結(jié)論 DMPP在一定濃度范圍內(nèi)可以抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤在CAM上的生長,這個效應(yīng)是由DMPP直接抑制血管發(fā)育和血管生成產(chǎn)生的。另外，DMPP下調(diào)Ang-1和HIF-2α信號的表達對抑制血管生成起著關(guān)鍵作用。
【圖文】：

圖 1.DMPP 抑制膠質(zhì)瘤在雞胚絨毛尿囊膜上的生長U87 膠質(zhì)瘤細胞收集并移植到孵育 8 天的雞胚 CAM 上，繼續(xù)孵育 5 天后取材。圖 A 是 DMPP 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。圖 B-E 是膠質(zhì)瘤細胞移植到 CAM 上，加入生理鹽水的對照組（圖 B）和加入 0.02-0.32mM 三個不同濃度 DMPP 處理后實驗組（圖 C-E）膠質(zhì)瘤的外觀形態(tài)。圖 B’-E’是膠質(zhì)瘤組織在圖 B-E 白色虛

圖 2：在體外培養(yǎng) U87 細胞加入 DMPP 后并不影響其增殖和存活U87 細胞在體外培養(yǎng)加入 DMPP(0.02-0.32mM)繼續(xù)培養(yǎng) 24 小時（圖 A-D）和 48 小時（圖 A’-D’）后細胞的形態(tài)。實驗表明 DMPP 并不影響 U87 細胞的增殖（圖 A”-D”和 F）。此外，在加入 DMPP 繼續(xù)培養(yǎng) 24 小時和 48 小時（圖 A-D 和 A’-D’）后 U87 細胞的活力（圖 E）也不受影響。圖 F 說明的是 U87
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41

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本文編號：2549651