【摘要】：第一章匹羅卡品顳葉癲癇小鼠模型的建立及癲癇后海馬神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞病理改變的研究 目的：建立C57BL/6小鼠匹羅卡品顳葉癲癇模型,探討癲癇后小鼠海馬神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞病理改變。 方法：6-8周齡健康雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組腹腔注射匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE),對(duì)照組腹腔注射等量無菌生理鹽水。SE后觀察小鼠行為學(xué)表現(xiàn)并記錄慢性期自發(fā)性癇性發(fā)作(SS)。SE后2h,24h,7d,15d,60d分別行海馬組織NeuN和GFAP免疫組化染色,并以同樣的分組方法檢測(cè)相同數(shù)量的對(duì)照組小鼠。 結(jié)果： 1.造模成功率為48.0%,總體死亡率為40.3%。模型小鼠在慢性期SS的發(fā)生率為87.5%,平均潛伏期為11.1+4.8天。SS多在晝夜交替時(shí)出現(xiàn),持續(xù)時(shí)間一般為10-40秒,通常不超過1分鐘。 2. NeuN免疫組化染色：匹羅卡品致SE后小鼠海馬CA1-CA3區(qū)各層、齒狀回門區(qū)均有不同程度的神經(jīng)元缺失。其中CA1區(qū)在24小時(shí)以后,神經(jīng)元損傷持續(xù)存在(P0.05),門區(qū)神經(jīng)元損傷在SE后2h即出現(xiàn),之后也無恢復(fù)；CA3區(qū)神經(jīng)元早期有丟失,SE后7天有所恢復(fù),慢性期后又再次出現(xiàn)CA3區(qū)神經(jīng)元的損傷；DG區(qū)在SE后7天有短暫上升,余時(shí)間點(diǎn)變化相對(duì)不明顯,少數(shù)情況下可見顆粒細(xì)胞呈現(xiàn)彌散化現(xiàn)象。 3. GFAP免疫組化染色：膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)癇性發(fā)作的反應(yīng)在形態(tài)學(xué)上來說比神經(jīng)元出現(xiàn)要晚,在SE后24h時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)水腫樣表現(xiàn),表現(xiàn)為CA1、CA3及門區(qū)陽(yáng)性表達(dá)面積增加(P0.05),；7d后各區(qū)域陽(yáng)性表達(dá)面積增加明顯(P0.05)；進(jìn)入慢性期(2m)后陽(yáng)性染色面積介于對(duì)照組和7d之間,形成膠質(zhì)瘢痕。 結(jié)論： 1.匹羅卡品顳葉癲癇小鼠模型表現(xiàn)出典型的海馬神經(jīng)元丟失及膠質(zhì)增生病理改變。 2.C57BL/6小鼠匹羅卡品模型是一種理想的顳葉癲癇模型。 第二章Pannexin通道蛋白在匹羅卡品顳葉癲癇小鼠海馬的表達(dá)變化 目的：探討Pannexin通道蛋白在匹羅卡品顳葉癲癇小鼠海馬的表達(dá)變化 方法：6-8周齡健康雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組腹腔注射匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE),對(duì)照組腹腔注射等量無菌生理鹽水。SE后2h,24h,7d,15d,60d分別行海馬組織Panxl和Panx2免疫組化染色及Panx1、Panx2與NeuN、 GFAP的熒光雙標(biāo)染色。 結(jié)果： 1.在正常對(duì)照組,Panxl和Panx2均表達(dá)于CA1-CA3區(qū)錐體細(xì)胞層,在始層、透明層及輻射層可見Panx陽(yáng)性神經(jīng)元的散在分布；在齒狀回結(jié)構(gòu)中,顆粒細(xì)胞呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá),齒狀回分子層及門區(qū)亦可見Panx蛋白的散在表達(dá)；SE后Panx1和Panx2在海馬主細(xì)胞層表達(dá)呈下降趨勢(shì),而Panx1在非主細(xì)胞區(qū)域(尤其是輻射層)表達(dá)增加。 2. Panx1、Panx2與NeuN熒光雙標(biāo)：在正常對(duì)照組,基本上所有Panx1及Panx2陽(yáng)性的細(xì)胞均表現(xiàn)出NeuN染色陽(yáng)性。雙標(biāo)記的Panx1Panx2陽(yáng)性神經(jīng)元,在CA1、CA3椎體細(xì)胞層7d時(shí)減至最低；Hilar區(qū)雙標(biāo)記的神經(jīng)元在SE后各時(shí)期均下降 3.Panx1、Panx2與GFAP熒光雙標(biāo)：在對(duì)照組中,GFAP陽(yáng)性的細(xì)胞均未見Panx1Panx2的表達(dá),SE后的2h、7d、15d、60d可以觀察到Panx1與GFAP共表達(dá)細(xì)胞,以CA1、CA3始層、輻射層最為明顯,SE后7d及15d最為顯著；整個(gè)過程中均未觀察到Panx2與GFAP雙重染色的細(xì)胞。 結(jié)論： 1.匹羅卡品顳葉癲癇小鼠海馬Panx1和Panx2通道蛋白存在動(dòng)態(tài)表達(dá)變化。 2.SE后Panx1通道蛋白在小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞中顯著表達(dá)。 第三章Pannexin通道對(duì)顳葉癲癇小鼠癇性發(fā)作及海馬神經(jīng)元.膠質(zhì)細(xì)胞可塑性的調(diào)控 目的：探討在活體內(nèi)阻斷Panx通道對(duì)匹羅卡品誘導(dǎo)的癇性發(fā)作的影響,并觀察慢性期(SE后60d)海馬神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞病理的變化。 方法：6-8周齡健康雄性C57BL/6小鼠,隨機(jī)分為Cbx干預(yù)組、10Panx干預(yù)組及ACSF對(duì)照組,分別予側(cè)腦室注射Cbx、10Panx及ACSF。5小時(shí)后行匹羅卡品顳葉癲癇模型制作。在給藥后2個(gè)小時(shí)內(nèi)觀察第一次出現(xiàn)3級(jí)發(fā)作的間隔時(shí)間、各級(jí)別癇性發(fā)作所占的比例及死亡率。SE后60d各組小鼠分別行海馬組織NeuN和GFAP免疫組化染色。 結(jié)果： 1.癲癇敏感性測(cè)定結(jié)果顯示：10Panx干預(yù)組及Cbx干預(yù)組出現(xiàn)第一次3級(jí)或以上發(fā)作的平均時(shí)間分別為71.40±37.33min及59.53±34.69min,均較ACSF對(duì)照組(18.10+6.45min)顯著延長(zhǎng)。此外,各組癇性發(fā)作的嚴(yán)重程度也有不同,空白對(duì)照組5級(jí)以上發(fā)作占50%,而10Panx干預(yù)組及Cbx干預(yù)組5級(jí)以上發(fā)作分別僅占20%及13.3%。2小時(shí)內(nèi)三組的死亡率分別為20%(10Panx干預(yù)組),13%(Cbx干預(yù)組)及40%(ACSF對(duì)照組)。 2. NeuN免疫組化染色：SE后60天各組小鼠海馬CA1-CA3區(qū)各層、齒狀回門區(qū)均有不同程度的神經(jīng)元缺失。與ACSF對(duì)照組相比,10Panx干預(yù)組及Cbx干預(yù)組在SE后60天海馬CA1、CA3區(qū)錐體細(xì)胞層神經(jīng)元受損相對(duì)較輕(P0.05),10Panx干預(yù)組門區(qū)神經(jīng)元也可觀察到同樣現(xiàn)象(P0.05),DG區(qū)差異相對(duì)不明顯。 3. GFAP免疫組化染色：三組均可觀察到膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。10Panx干預(yù)組及Cbx干預(yù)組在海馬CA1區(qū)及Cbx干預(yù)組在DG區(qū)膠質(zhì)增生均較對(duì)照組程度輕(P0.05),其余區(qū)域膠質(zhì)增生在干預(yù)組及對(duì)照組并無顯著差異。 結(jié)論： 1.在活體阻斷Panx通道可以抑制匹羅卡品誘導(dǎo)的癇性發(fā)作。 2. Panx通道可能參與顳葉癲癇海馬神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞可塑性的調(diào)控。
【圖文】：

海馬冠狀切面結(jié)構(gòu)圖示

倍、40倍物鏡下觀察各區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)改變。膠質(zhì)細(xì)胞增生的分析使用ImageTool軟件(UTHSC) [17](圖1-2)。首先設(shè)定一個(gè)代表陽(yáng)性染色的閾值，達(dá)到閾值的染色區(qū)域?qū)⒂上到y(tǒng)自動(dòng)轉(zhuǎn)變成純黑色，而之外的區(qū)域則變?yōu)榧儼咨珔^(qū)域，軟件自動(dòng)計(jì)算出黑色區(qū)域占整個(gè)切片區(qū)域的百分比，由此來計(jì)算膠質(zhì)細(xì)胞的增生程度。：’".k- ■ - .Jt圖1-2使用ImageTool軟件分析膠^閬赴鏨�。A為SE后60d模型小鼠CA3區(qū)GFAP免疫組化染色原圖（x4()0 ); B為軟件處理后的黑白圖像。1.2.5.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（S±s)表示，成組設(shè)計(jì)多樣本均數(shù)用單因素方差分析（ANOVA)或Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間比較用兩樣本t檢驗(yàn)或Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。統(tǒng)計(jì)分析和圖表繪制分別用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件和 Microsoft Office Excel 2010 進(jìn)行。1.3結(jié)果1.3.1 Pilo致TLE模型小鼠的行為學(xué)觀察1.3.1.1模型小鼠SE的行為學(xué)特點(diǎn)對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射東莨菪堿硝酸甲酯后，，未表現(xiàn)特殊反應(yīng)；實(shí)驗(yàn)組小鼠注射匹羅卡品5?15分鐘后
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R742.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 ;Cx31 is assembled and trafficked to cell surface by ER-Golgi pathway and degraded by proteasomal or lysosomal pathways[J];Cell Research;2005年06期

2 楊忠旭,欒國(guó)明,閆麗,張穎;顳葉癲癇大鼠模型的建立及長(zhǎng)期癲癇敏感性的研究[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2004年02期

本文編號(hào)：2547833