【摘要】：帕金森病(Parkinson's disease,PD)是全球第二大與老化相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病,多種綜合性因素參與PD的發(fā)生發(fā)展,然而其確切病理機(jī)制尚未完全闡明。PD主要病理特征為黑質(zhì)致密部多巴胺(Dopamine,DA)能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失及路易小體(Lewybody,LB)沉積,并伴有震顫麻痹等帕金森樣運(yùn)動(dòng)癥狀和抑郁等非運(yùn)動(dòng)癥狀。目前對(duì)于PD尚無(wú)理想的治療方法,依然沿用左旋多巴替代療法緩解PD的運(yùn)動(dòng)癥狀,但無(wú)法延緩PD的病理進(jìn)程,且長(zhǎng)期應(yīng)用還會(huì)引發(fā)一系列的副作用,甚至加重疾病進(jìn)程。因此,闡明PD病理機(jī)制對(duì)于尋找有效緩解PD病程的治療藥物尤為重要。研究表明氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、錯(cuò)誤折疊蛋白積聚、興奮性毒性、神經(jīng)再生障礙、神經(jīng)炎癥等病理機(jī)制協(xié)同參與PD病理進(jìn)程中DA能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失的過(guò)程。PD病理早期即可出現(xiàn)神經(jīng)炎癥反應(yīng),且炎癥反應(yīng)過(guò)程中不同神經(jīng)細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子可作為早期診斷PD的生物學(xué)指標(biāo)。研究表明星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放的促炎因子白介素-1β(Interleukin 1β,IL-1β)在PD病理過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,然而在動(dòng)物模型上應(yīng)用IL-1β受體拮抗劑并不能有效改善PD模型所致DA能神經(jīng)元丟失的現(xiàn)象。因此,深入闡明PD病理過(guò)程中IL-1β或其他多種病理因素介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥反應(yīng)和DA能神經(jīng)元損傷的確切病理機(jī)制,對(duì)于研發(fā)理想的PD神經(jīng)保護(hù)劑和探索PD治療新策略具有重大的科學(xué)意義。炎癥反應(yīng)的最初階段涉及細(xì)胞內(nèi)多種復(fù)合物的相互作用,這種多分子復(fù)合物組成的成分稱為“炎癥小體”。在2000年初,Tschopp和他的團(tuán)隊(duì)率先發(fā)現(xiàn)炎癥小體,并意識(shí)到組織損傷可以誘發(fā)固有免疫應(yīng)答從而激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)依賴的炎性反應(yīng)。炎癥小體位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),可以激活caspase家族,尤其是caspase-1,通過(guò)誘導(dǎo)caspase-1切割并釋放IL-1β和IL-18等促炎因子,最終產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。因此,炎癥小體在固有免疫系統(tǒng)抵抗病理性刺激的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nevous system,CNS)中,神經(jīng)細(xì)胞表面均表達(dá)IL-1β和IL-18的受體,且不同類型的炎癥小體在不同神經(jīng)細(xì)胞中各司其職,發(fā)揮神經(jīng)免疫炎癥的調(diào)節(jié)功能,近期神經(jīng)病理學(xué)研究者越來(lái)越關(guān)注炎癥小體在神經(jīng)炎癥過(guò)程中所發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用。炎癥小體種類繁多,本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明NOD樣受體家族蛋白3(NOD-like recptor protein 3,NLRP3)炎癥小體可能參與PD的發(fā)生過(guò)程,然而目前對(duì)于PD病理過(guò)程中炎癥小體調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥的病理機(jī)制尚未闡明。在前期研究基礎(chǔ)上,本文第一部分工作首先發(fā)現(xiàn)臨床PD患者血清存在炎癥小體激活的現(xiàn)象。應(yīng)用野生型(Wild type, WT)小鼠建立急性和慢性1-甲基,4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)PD小鼠模型,提取血清和原代骨髓源性巨噬細(xì)胞(Bone marrow derived macrophages, BMDM),并分離中腦、肝臟和脾臟組織,闡明不同炎癥小體類型在不同組織中發(fā)揮各自側(cè)重的作用,并發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體在PD病理過(guò)程中發(fā)揮主要的調(diào)控作用。此外,應(yīng)用立體定位在小鼠中腦黑質(zhì)致密部(Substantia nigra compact, SNc)注射siRNA-mus-NLRP3以抑制中腦SNc區(qū)NLRP3蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)siRNA-mus-NLRP3可抑制MPTP誘導(dǎo)的DA能神經(jīng)元損傷和膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化的現(xiàn)象,從整體水平闡述了NLRP3炎癥小體與PD的相關(guān)性。在此基礎(chǔ)上,第二部分工作應(yīng)用PD模式動(dòng)物一-Atp13a2基因缺失小鼠建立慢性MPTP/p PD小鼠模型,通過(guò)闡明Atpl3a2基因缺失誘導(dǎo)PD的病理機(jī)制的同時(shí)進(jìn)一步確證了NLRP3炎癥小體在PD病理?yè)p傷中的調(diào)控作用。結(jié)果顯示,ATP13A2通過(guò)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體的激活,抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)從而延緩PD進(jìn)程中DA能神經(jīng)元損傷,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。該結(jié)果提示可通過(guò)靶向調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞ATP13A2的表達(dá)或NLRP3炎癥小體的激活,調(diào)節(jié)PD病理進(jìn)程中神經(jīng)炎癥反應(yīng)的發(fā)生,為延緩PD病理進(jìn)程抗炎藥物的研發(fā)提供新的思路。由于DA能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失是PD病理進(jìn)程中本質(zhì)的特征,延緩DA能神經(jīng)元退行性變是PD重要的治療手段。因此,第三部分工作應(yīng)用caspase-1基因缺失小鼠或caspase-1特異性抑制劑Z-YVAD,闡明caspase-1除了通過(guò)炎癥小體激活介導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)之外,還可通過(guò)調(diào)控caspase-7/PARP1/AIF信號(hào)通路直接影響DA能神經(jīng)元的存活,為研發(fā)針對(duì)神經(jīng)炎癥和DA能神經(jīng)元損傷的神經(jīng)保護(hù)藥物提供了新的藥理學(xué)靶點(diǎn)。第一部分NLRP3-Caspase-1炎癥小體與PD發(fā)生的相關(guān)性研究目的：研究炎癥小體與PD發(fā)生的相關(guān)性及NLRP3炎癥小體對(duì)PD神經(jīng)損傷的影響。方法：ELISA檢測(cè)正常人和PD患者血清中細(xì)胞因子caspase-1和IL-1β的分泌。應(yīng)用3～4月齡雄性C57BL/6J小鼠分別建立急性和慢性MPTPPD模型,ELISA檢測(cè)小鼠血清中細(xì)胞因子caspase-1和IL-1β的分泌；western blotting檢測(cè)小鼠中腦組織中炎癥小體活化產(chǎn)物蛋白procaspase-1、caspase-1、proIL-1β和IL-1β的表達(dá),同時(shí)檢測(cè)小鼠中腦、肝臟、脾臟中NLRP1、NLRP2、NLRP3、NLRC4和AIM2(Absent in melanoma 2)炎癥小體蛋白的表達(dá)。分離急性和慢性MPTP模型小鼠BMDM,western blotting檢測(cè)BMDM中NLRP1、NLRP2、NLRP3、 NLRC4和AIM2炎癥小體蛋白的表達(dá)：同時(shí)給予BMDM預(yù)孵育100ng/ml脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)6 h,再分別給予不同炎癥小體的特異性激活劑5mM ATP刺激30 min、10μg/ml flagellin刺激12h、轉(zhuǎn)染10μg/ml MDP 18 h和2μg/ml dsDNA 48h后,ELISA檢測(cè)BMDM細(xì)胞上清炎癥因子IL-1β的分泌；western blotting檢測(cè)BMDM中procaspase-1、caspase-1、proIL-1β和IL-1p的蛋白表達(dá)。在小鼠中腦SNc區(qū)立體定位注射慢病毒包裹的NLRP3小干擾RNA(LV3-mus-Nlrp3)7天后建立急性MPTP模型,免疫熒光檢測(cè)小鼠SNc區(qū)mus-Nlrp3-GFP綠色熒光蛋白表達(dá),western blotting檢測(cè)小鼠SNc區(qū)NLRP3蛋白的表達(dá),酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)免疫組織化學(xué)染色的方法檢測(cè)siRNA-mus-Nlrp3對(duì)MPTP介導(dǎo)的中腦DA能神經(jīng)元的影響、膠質(zhì)源性纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acid protein,GFAP)和離子鈣接頭蛋白(Ionized calcium binding adapter molecule 1, Iba-1)免疫組化檢測(cè)siRNA-mus-Nlrp3對(duì)MPTP介導(dǎo)的中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化的影響。結(jié)果：1)PD患者血清中caspase-1和IL-1β分泌水平較正常人顯著增加,慢性MPTP/p PD模型小鼠血清和中腦組織中caspase-1和IL-1β表達(dá)水平顯著上調(diào)；2)與生理鹽水組相比,急性和慢性MPTP模型小鼠中腦組織中NLRP1和NLRP3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)；急性MPTP模型小鼠肝臟組織中NLRP2、NLRP3和NLRC4蛋白表達(dá)上調(diào),而慢性MPTP模型小鼠肝臟中僅NLRP2和NLRP3蛋白表達(dá)上調(diào)：急性和慢性MPTP模型小鼠脾臟組織中NLRP3和AIM2蛋白表達(dá)上調(diào)；3)離體培養(yǎng)的急性和慢性MPTP模型小鼠的BMDM中,NLRP2和NLRP3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)；給予特異性炎癥小體激活劑刺激后,ATP和flagellin均可誘導(dǎo)BMDM細(xì)胞中caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)上調(diào),其中ATP作為NLRP3炎癥小體激活劑所誘導(dǎo)的caspase-1和IL-1β表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象最為顯著；4)小鼠中腦SNc區(qū)立體定位注射mus-Nlrp3-GFP后可在SNc區(qū)檢測(cè)到綠色熒光蛋白表達(dá),其中siRNA-mus-Nlrp3-2764可下調(diào)NLRP3蛋白表達(dá),抑制率達(dá)63%；5)siRNA-mus-Nlrp3可顯著抑制MPTP介導(dǎo)的中腦TH神經(jīng)元的丟失；6)siRNA-mus-Nlrp3減輕MPTP誘導(dǎo)的中腦SNc區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活化。結(jié)論：1)PD病理?xiàng)l件下存在炎癥小體激活的現(xiàn)象；2)NLRP3炎癥小體是PD病理過(guò)程中發(fā)揮主要調(diào)控作用的炎癥小體；3)siRNA-mus-Nlrp3減少M(fèi)PTP誘導(dǎo)的DA能神經(jīng)元丟失,抑制MPTP介導(dǎo)的中腦膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。第二部分Atp13a2基因缺失在NLRP3-Caspase-1炎癥小體激活介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用及其機(jī)制目的；闡明星形膠質(zhì)細(xì)胞ATP13A2抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)的機(jī)制。方法:Western blotting方法觀察慢性MPTP/p PD小鼠模型中腦組織中ATP13A2蛋白表達(dá)變化。剪取小鼠鼠尾并應(yīng)用Real-time PCR及western blotting方法分別從基因和蛋白水平鑒定Atp13a2基因敲除小鼠。應(yīng)用3～4月齡雄性Atpl3a+/+和Atp13a2-/-小鼠建立慢性MPTP/p PD模型,高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)檢測(cè)小鼠紋狀體內(nèi)單胺類遞質(zhì)和氨基酸的水平。應(yīng)用組織透射電鏡法觀察Atpl3a2基因缺失對(duì)小鼠中腦組織溶酶體形態(tài)的改變。免疫熒光檢測(cè)Atpl3a2基因缺失對(duì)小鼠中腦自噬標(biāo)志物L(fēng)C3斑點(diǎn)積聚的影響,同時(shí)應(yīng)用western blotting方法觀察自噬信號(hào)通路中LC3和p62蛋白的表達(dá)以及自噬底物a-synuclein的表達(dá)變化。應(yīng)用轉(zhuǎn)棒、爬桿和開(kāi)場(chǎng)的行為學(xué)檢測(cè)手段評(píng)價(jià)Atp13a2基因缺失對(duì)MPTP/p所致運(yùn)動(dòng)功能障礙的影響。應(yīng)用免疫組化染色方法檢鋇Atp13a2基因缺失對(duì)TH標(biāo)記的DA能神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)目的改變,并結(jié)合體視學(xué)計(jì)數(shù)系統(tǒng)進(jìn)行定量分析,同時(shí)采用western blotting方法檢測(cè)小鼠中腦組織中TH蛋白的表達(dá)。免疫熒光雙標(biāo)法觀察兩種基因型小鼠中腦組織中TH神經(jīng)元和a-synuclein的共定位、TH神經(jīng)元和在體活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)的共定位。GFAP和Iba-1免疫組化觀察Atp13a2基因缺失對(duì)MPTP/p所致星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化的影響,并結(jié)合體視學(xué)觀察膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的改變和定量計(jì)數(shù)各自細(xì)胞數(shù)目。Western blotting方法檢測(cè)小鼠中腦組織中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-IKKβ和p65的表達(dá),同時(shí)檢測(cè)炎癥小體活化第二信號(hào)中相關(guān)蛋白NLRP3、procaspase-1、caspase-1、proIL-1β和IL-1β的表達(dá)。離體培養(yǎng)新生1～3天Atp13a2+/+和Atpl3a2-/-小鼠中腦原代星形膠質(zhì)細(xì)胞,同時(shí)應(yīng)用Real-time PCR及western blotting方法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞中ATP13A2的表達(dá)。給予Atpl3a2+/+小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞50μM MPP+刺激48 h后,收集細(xì)胞蛋白,western blotting方法檢測(cè)MPP+對(duì)ATP13A2蛋白表達(dá)的影響。應(yīng)用H2DCF-DA熒光探針檢測(cè)Atpl3a2基因缺失對(duì)MPP+介導(dǎo)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響。Real-time PCR檢測(cè)MPP+對(duì)兩種基因型星形膠質(zhì)細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、1L-10和營(yíng)養(yǎng)因子GDNF、FGF2水平的影響。給予兩種基因型小鼠原代星形膠質(zhì)50μM MPP+刺激48 h后,收集細(xì)胞上清,給予WT小鼠原代中腦神經(jīng)元(星形膠質(zhì)細(xì)胞上清與神經(jīng)元培養(yǎng)基1：2混合)孵育6 h,TH免疫組化觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞上清對(duì)中腦DA能神經(jīng)元數(shù)目及軸突長(zhǎng)度的影響。通過(guò)給予兩種基因型原代星形膠質(zhì)細(xì)胞不同炎癥小體的特異性激活劑,ELISA檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞上清中炎癥因子IL-1β的分泌。給予兩種基因型原代星形膠質(zhì)細(xì)胞50μM MPP+刺激1.5、3、6、12、24 h后western blotting方法檢測(cè)炎癥小體活化的第一信號(hào)(NF-κB信號(hào)通路)相關(guān)蛋白p-IKKβ和p65的表達(dá)；MPP+刺激3、6、12、24、48 h后檢測(cè)炎癥小體活化的第二信號(hào)相關(guān)蛋白NLRP3、 procaspase-1、caspase-1、proIL-ip和IL-1β的表達(dá)。應(yīng)用小干擾RNA技術(shù)(ATP13A2-siRNA,100 nM)干擾WT小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞ATP13A2蛋白表達(dá),收集細(xì)胞上清和胞漿蛋白,western blotting方法檢測(cè)細(xì)胞上清IL-1β的分泌和胞漿中NLRP3、procaspase-1、caspase-1、proIL-1β和IL-1β的蛋白表達(dá)。Western blotting和免疫熒光方法觀察兩種基因型星形膠質(zhì)細(xì)胞或干擾ATP13A2蛋白表達(dá)的WT星形膠質(zhì)細(xì)胞中給予MPP+刺激后組織蛋白酶B(Cathepsin B)的表達(dá)情況。兩種基因型小鼠中腦原代星形膠質(zhì)預(yù)孵育cathepsin B活性抑制劑Z-FA-FMK20 μM 1 h后,給予50μM MPP+刺激48 h并收集細(xì)胞上清和胞漿蛋白,western blotting方法檢測(cè)炎癥小體活化的第二信號(hào)相關(guān)蛋白caspase-1和IL-1β的表達(dá)情況。在兩種基因型原代星形膠質(zhì)細(xì)胞上轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 (-)-V5-ATP 13 A2質(zhì)粒,收集細(xì)胞上清,ELISA方法檢測(cè)ATP13A2過(guò)表達(dá)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放TNF-α和IL-1β的影響,并用western blotting方法檢測(cè)胞漿中ATP13A2、cathepsin B、 p-IKKβ-、p65、NLRP3、caspase-1、proIL-1β和IL-1β蛋白的表達(dá)。結(jié)果：1)MPTP/p PD模型小鼠中腦ATP13A2蛋白表達(dá)水平降低至對(duì)照組的58%；2)Atp13a2基因缺失誘導(dǎo)小鼠中腦組織溶酶體膜破裂、溶酶體結(jié)構(gòu)完整性受損,并促進(jìn)MPTP/p誘導(dǎo)的自噬功能障礙、增加中腦組織中a-synuclein蛋白的表達(dá)；3)Atp13a2基因缺失顯著抑制紋狀體中多巴胺及其代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ)水平；并可抑制紋狀體中天冬氨酸和γ-氨基丁酸的釋放水平、促進(jìn)L-絲氨酸的釋放水平,而對(duì)其它氨基酸基礎(chǔ)狀態(tài)下的釋放水平并無(wú)顯著影響；4)Atp13a2基因缺失誘導(dǎo)小鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙；5)Atp13a2基因缺失誘導(dǎo)小鼠中腦SNc區(qū)TH神經(jīng)元的丟失,進(jìn)一步促進(jìn)MPTP/p誘導(dǎo)的TH神經(jīng)元內(nèi)a-synuclein的積聚和ROS的生成；6)Atpl3a2基因缺失誘導(dǎo)小鼠中腦SNc區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活化；7)Atp13a2基因缺失加重MPTP/p誘導(dǎo)的中腦NLRP3炎癥小體的激活；8)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)ATP13A2蛋白；給予WT星形膠質(zhì)細(xì)胞50μM MPP+刺激48 h,可顯著下調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞中ATP13A2蛋白的表達(dá)；9)Atp13a2基因缺失加重MPP+誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS的生成；并進(jìn)一步促進(jìn)MPP+介導(dǎo)的促炎因子的轉(zhuǎn)錄水平、抑制抑炎因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的轉(zhuǎn)錄水平,其中對(duì)IL-1β轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控最為顯著；10)將MPP+(50μM)刺激的AtP13a2+/+和Atp13a2-/-的星形膠質(zhì)細(xì)胞上清與WT小鼠中腦原代神經(jīng)元共孵育,免疫組化顯示Atp13a2基因缺失的星形膠質(zhì)細(xì)胞上清可誘導(dǎo)WT小鼠TH神經(jīng)元陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目的減少及突起長(zhǎng)度的縮短；11)給予兩種基因型小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞不同炎癥小體特異性激活劑刺激,發(fā)現(xiàn)Atp13a2基因缺失主要誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的激活；12) Atp13a2基因缺失加重MPP+誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活的第一信號(hào)相關(guān)蛋白p-IKKβ和p65的表達(dá)增加；同時(shí)進(jìn)一步促進(jìn)MPP+誘導(dǎo)的NLRP3、caspase-1、proIL-1β和IL-1β的蛋白表達(dá)；13)給予WT小鼠中腦原代星形膠質(zhì)細(xì)胞ATP13A2-siRNA(100nM)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞中ATP13A2蛋白的表達(dá),并可加重MPP+介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的激活；14) Atpl3a2基因缺失或ATP13A2蛋白表達(dá)下調(diào)促進(jìn)MPP+誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞cathepsin B的表達(dá);15)Cathepsin B抑制劑Z-FA-FMK可有效抑制Atpl3a2基因缺失或MPP+介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的激活；16)星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)表達(dá)ATP13A2抑制Atp13a2基因缺失或MPP+誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞cathepsin B蛋白表達(dá)上調(diào)和NLRP3炎癥小體的激活。結(jié)論：1)Atp13a2基因缺失誘導(dǎo)中腦SNc區(qū)DA能神經(jīng)元丟失并進(jìn)一步加劇MPTP/p誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化；2)星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)ATP13A2,并參與神經(jīng)毒素MPP+介導(dǎo)的病理反應(yīng)；3)星形膠質(zhì)細(xì)胞中敲除或敲減ATP13A2加劇MPP+誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體活化,促進(jìn)DA能神經(jīng)元損傷；4)星形膠質(zhì)細(xì)胞ATP13A2通過(guò)調(diào)節(jié)溶酶體cathepsin B的活性抑制NLRP3炎癥小體的活化。第三部分靶向調(diào)控Caspase-1對(duì)DA能神經(jīng)元損傷的影響及其機(jī)制目的：研究靶向調(diào)控炎癥小體組分caspase-1對(duì)MPTP/p誘導(dǎo)的DA能神經(jīng)元損傷的影響及其機(jī)制。方法：Western blotting方法檢測(cè)MPTP/p對(duì)小鼠中腦組織caspase-1蛋白表達(dá)的影響。應(yīng)用3～4月齡Caspase-1+/+和Caspase-1-/-小鼠建立慢性MPTP/p PD模型,Nissl's染色觀察MPTP/p對(duì)兩種基因型小鼠中腦SNc區(qū)神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)目的改變。TH免疫組化檢測(cè)MPTP/p對(duì)兩種基因型小鼠中腦SNc區(qū)DA能神經(jīng)元數(shù)目的改變,并結(jié)合體視學(xué)計(jì)數(shù)進(jìn)行定量分析。采用轉(zhuǎn)棒、爬桿和開(kāi)場(chǎng)的小鼠行為學(xué)方法評(píng)價(jià)Caspase-1+/+和Caspase-1-/-小鼠在基礎(chǔ)狀態(tài)和MPTP/p模型下運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力。Western blotting方法檢測(cè)小鼠中腦凋亡相關(guān)蛋白B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell leukemia/lymphoma,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶7(Cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase-7)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(Poly (ADP-ribose) polymerase1,PARP1)和凋亡誘導(dǎo)因子(Release of apoptosis inducing factor, AIF)蛋白的表達(dá)。離體培養(yǎng)孕13～16天Caspase-1+/+和Caspase-1-/-小鼠中腦原代神經(jīng)元,并給予10μM MPP+刺激12 h,TH免疫組化檢測(cè)神經(jīng)元數(shù)目和突起長(zhǎng)度。培養(yǎng)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞株,給予caspase-1特異性活性抑制劑Z-YVAD 10μM預(yù)孵育1 h后,200 μM MPP+刺激48 h,收集細(xì)胞蛋白,western blotting方法檢測(cè)caspase-1、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)。在SH-SY5Y細(xì)胞株上給予Z-YVAD 10μM預(yù)孵育1 h后再用200μM MPP+刺激48 h,采用Annexin-V和PI雙染并結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力；并應(yīng)用Hoechst 33342熒光染色觀察凋亡細(xì)胞；同時(shí)結(jié)合western blotting方法檢測(cè)Z-YVAD對(duì)MPP+介導(dǎo)的caspase-7、PARP1和AIF蛋白表達(dá)的影響。應(yīng)用Real-timePCR和雙酶切技術(shù)在人源性SH-SY5Y細(xì)胞株構(gòu)建3HA-cleaved caspase-7質(zhì)粒,通過(guò)在SH-SY5Y細(xì)胞上過(guò)表達(dá)cleaved caspase-7并結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)和western blotting方法觀察其對(duì)MPP+介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果：1)與生理鹽水組相比,MPTP/p誘導(dǎo)小鼠中腦成熟體caspase-1蛋白表達(dá)上調(diào),而對(duì)procaspase-1的表達(dá)無(wú)影響；2)基礎(chǔ)狀態(tài)下,caspase-1基因缺失對(duì)小鼠中腦SNc區(qū)神經(jīng)元數(shù)目以及TH神經(jīng)元數(shù)目無(wú)顯著影響；caspase-1基因缺失可顯著抑制MPTP/p誘導(dǎo)的小鼠中腦SNc區(qū)TH神經(jīng)元的丟失；3)Caspase-1基因缺失可顯著改善MPTP/p誘導(dǎo)的小鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙；4)Caspase-1基因缺失可改善MPTP/p誘導(dǎo)的抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)、抑制Bax表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象；5)Caspase-1基因缺失通過(guò)抑制MPTP/p介導(dǎo)的caspase-7的切割,進(jìn)而抑制PARP1/AIF信號(hào)通路的激活,發(fā)揮抗凋亡的保護(hù)作用；6)Caspase-1基因缺失改善MPP+誘導(dǎo)的中腦TH神經(jīng)元數(shù)目的丟失和突起長(zhǎng)度縮短的現(xiàn)象；7)Caspase-1抑制劑Z-YVAD (10μM)可抑制MPP+(200μM誘導(dǎo)的SH-SY5Y中成熟體caspase-1蛋白表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象,并可上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)并下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)；8)Z-YVAD抑制MPP+介導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡；9)SH-SY5Y細(xì)胞過(guò)表達(dá)cleaved caspase-7顯著抑制Z-YVAD所發(fā)揮的抗神經(jīng)元凋亡的作用,并促進(jìn)PARP1入核和胞漿內(nèi)AIF的表達(dá)上調(diào)。結(jié)論：1)MPTP/MPP+可誘導(dǎo)procaspase-1切割成caspase-1,提示成熟體caspase-1參與PD病理反應(yīng)；2)Caspase-1基因缺失抑制MPTP/p誘導(dǎo)的小鼠中腦DA能神經(jīng)元丟失和運(yùn)動(dòng)功能障礙；3)Z-YVAD抑制caspase-1的活性,抑制caspase-7活化介導(dǎo)的PARP1/AIF信號(hào)通路的激活,發(fā)揮抗神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用。綜上所述,本文工作的主要?jiǎng)?chuàng)新之處在于：1.發(fā)現(xiàn)NLRP3-Caspase-1炎癥小體激活與PD發(fā)生的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)PD患者和MPTP PD小鼠模型中存在炎癥小體激活的現(xiàn)象；其中NLRP3炎癥小體激活在PD的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮主要的調(diào)控作用；應(yīng)用小干擾RNA技術(shù)抑制小鼠中腦SNc區(qū)NLRP3蛋白的表達(dá),可顯著減輕MPTP介導(dǎo)的DA能神經(jīng)元丟失和膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化的現(xiàn)象,為靶向NLRP3炎癥小體激活而緩解PD的臨床藥物研發(fā)積累了學(xué)術(shù)基礎(chǔ)。2.闡明星形膠質(zhì)細(xì)胞ATP13A2抑制NLRP3-Caspase-1炎癥小體活化,減輕PD進(jìn)程中的神經(jīng)炎癥研究從整體、細(xì)胞和分子水平闡明Atpl3a2基因缺失可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng),促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞溶酶體釋放cathepsin B激活NLRP3炎癥小體,加劇DA能神經(jīng)元損傷,從而闡明Atpl3a2基因突變參與PD發(fā)生的病理機(jī)制,并揭示星形膠質(zhì)細(xì)胞中的ATP13A2參與調(diào)控神經(jīng)炎癥反應(yīng),為靶向神經(jīng)炎癥的藥物在Kufor-Rakeb綜合征或溶酶體功能障礙類疾病的神經(jīng)保護(hù)治療的研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。3.揭示靶向調(diào)控caspase-1發(fā)揮抗DA能神經(jīng)元凋亡的新機(jī)制研究進(jìn)一步闡明敲除炎癥小體關(guān)鍵性組分caspase-1可緩解PD病理進(jìn)程中DA能神經(jīng)元損傷,并從細(xì)胞和分子水平闡明caspase-1特異性活性抑制劑通過(guò)調(diào)節(jié)caspase-7/PARP1/AIF信號(hào)通路發(fā)揮抗神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用,并揭示caspase-7成熟體是caspase-1介導(dǎo)凋亡信號(hào)所必需的關(guān)鍵分子,為抗凋亡藥物在PD神經(jīng)保護(hù)治療中的研發(fā)提供了新的靶標(biāo)和策略。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R742.5
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本文編號(hào)：2537947