京尼平苷對魚藤酮誘導的原代神經(jīng)細胞損傷的保護作用

發(fā)布時間：2019-08-08 19:25

【摘要】：背景：神經(jīng)退行性疾病是在老年人中一種非常常見的疾病，雖然目前尚不完全清楚其發(fā)病機制，但已有證據(jù)顯示氧化應激參與了神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制�？紤]到糖尿病與神經(jīng)退行性疾病的相互關(guān)系，用治療糖尿病的藥物如GLP-1受體激動劑治療神經(jīng)退行性疾病已經(jīng)成為一種新的思路。京尼平苷作為一種中藥單體，同時也已經(jīng)證明是GLP-1的受體激動劑。在我們的前期研究中已經(jīng)證實京尼平苷可以保護阿爾茨海默癥動物模型的行為損傷、tau蛋白過度磷酸化以及多層次的結(jié)構(gòu)損傷。因此，我們假設京尼平苷在細胞水平有抗凋亡的能力。目的：研究京尼平苷對魚藤酮誘導的原代神經(jīng)細胞損傷的保護作用。方法：取剛出生1~2天昆明小鼠的大腦皮層進行原代培養(yǎng)，培養(yǎng)基為Neurobasal+2%B27+0.25mM+0.5%青/鏈霉素。細胞培養(yǎng)每三天換一次液，細胞培養(yǎng)至第7天開始進行后續(xù)的實驗。 1.細胞培養(yǎng)至第7天，更換培養(yǎng)基后在培養(yǎng)基中分別加入終濃度為0nM，0.5nM，1nM，3nM，5nM魚藤酮培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后加入CCK-8檢測適合的魚藤酮濃度。結(jié)果顯示0.5nM魚藤酮濃度為最適濃度。 2.細胞培養(yǎng)至第7天，，更換培養(yǎng)基后在培養(yǎng)基中分別加入終濃度為0M、10M、50M、100M、200M京尼平苷預培養(yǎng)2h。再在培養(yǎng)集中加入終濃度為0.5nM的魚藤酮培養(yǎng)48h。最后，取適量培養(yǎng)基用乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒檢測培養(yǎng)集中LDH含量，計算細胞損傷程度。 3細胞培養(yǎng)至第7天，按照上述培養(yǎng)方法加入京尼平苷和魚藤酮進行培養(yǎng)。然后提取各實驗組神經(jīng)元內(nèi)的蛋白進行Western Blot檢測。檢測蛋白包括經(jīng)典的凋亡生物標志物Bcl-2、Pro-Caspaes-3(35KD)、Cleaved Caspases-3(17KD)。結(jié)果： 1細胞活性隨著魚藤酮濃度的增加會逐漸降低。與對照組相比，0.5nM魚藤酮濃度組細胞活性明顯降低（p＜0.05）；1nM，3nM，5nM濃度組細胞活性也顯著降低（p＜0.01）并且呈現(xiàn)劑量依賴性（各濃度組間p＜0.05）。 2單加京尼平苷處理原代神經(jīng)元細胞，LDH釋放量沒有顯著變化（P＞0.05）。京尼平苷預處理2小時后再用魚藤酮處理48小時，與對照組相比，其余各組LDH釋放量均有顯著增加（p＜0.01）；與魚藤酮組相比，10μM京尼平苷組LDH釋放量明顯降低（p＜0.05），50μM，100μM，200μM京尼平苷組LDH釋放量均顯著降低（p＜0.01）。 3與魚藤酮組相比，京尼平苷可以使Bcl-2和Pro-Caspases-3蛋白的表達量明顯增加（p＜0.05），相反的，京尼平苷預處理后可以使Cleaved Caspase-3蛋白的表達量明顯降低（p＜0.05）。結(jié)論： 1.魚藤酮在低劑量情況下即可誘導細胞的損傷，因此在用魚藤酮誘導細胞損傷時不宜用過高濃度，低劑量即可。 2.京尼平苷對在一定的魚藤酮濃度下誘導的神經(jīng)細胞損傷有保護作用。 3.京尼平苷可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Pro-Caspases-3、Cleaved Caspase-3的活性起到抗凋亡的作用。
【圖文】：

海馬神經(jīng)元培養(yǎng),大腦皮層,胞體

山西醫(yī)科大學碩士學位論文根據(jù)公式（細胞數(shù)/mL=A/5×25×10000×B）計算細胞懸液的細胞數(shù)格細胞總數(shù)，B：細胞懸液稀釋倍數(shù)。驗結(jié)果代大腦皮層海馬神經(jīng)元培養(yǎng)胞接種 4~6 小時后開始貼壁，胞體呈圓形或者橢圓形，無突觸分支天，多數(shù)細胞從胞體長出個別突起，但神經(jīng)元胞體仍然較小。培養(yǎng)經(jīng)元胞體生長豐滿，且胞體發(fā)亮，周圍有明顯的光暈，胞體周圍的經(jīng)元軸突、樹突生長延伸，相互交錯形成神經(jīng)網(wǎng)絡。

碩士學位論文,WesternBlot檢測,相關(guān)蛋白,細胞凋亡