【摘要】：骨骼肌細(xì)胞的一個重要特性是其具有的可興奮性,在神經(jīng)支配下,骨骼肌細(xì)胞能夠產(chǎn)生并傳導(dǎo)動作電位,通過興奮收縮耦連機(jī)制,最終引發(fā)肌肉收縮,產(chǎn)生運(yùn)動。此收縮運(yùn)動過程中肌肉所需要的電生理活性主要是由離子通道精細(xì)地產(chǎn)生并控制的。離子通道是一種成孔蛋白,這種蛋白能夠篩選某種特定類型的離子,并允許其依靠電化學(xué)梯度力經(jīng)過通道轉(zhuǎn)移,從而建立和控制細(xì)胞質(zhì)膜間的微弱電壓差發(fā)揮作用,如靜息膜電位及動作電位的產(chǎn)生等。肌肉運(yùn)動的電生理活性主要是通過鈉通道、鈣通道及鉀通道產(chǎn)生并維持的。由此可知,當(dāng)特異性表達(dá)于肌肉的離子通道結(jié)構(gòu)或功能出現(xiàn)異常時,可能會導(dǎo)致肌肉運(yùn)動的異常,從而引起疾病,主要表現(xiàn)為肌肉可興奮性的改變,而這種病理改變主要是由于編碼離子通道的基因異�；蚧虮磉_(dá)異常而引發(fā)的。低鉀性周期性麻痹(Hypokalemic periodic paralysis, HypoKPP)是離子通道病的一種,其特點(diǎn)為肌肉的可興奮性降低,臨床表現(xiàn)為反復(fù)突發(fā)的肌無力,并伴隨有明顯的血鉀水平降低。HypoKPP根據(jù)病因可分類為：家族性周期性麻痹(Familial periodic paralysis, FPP)、甲狀腺毒性周期性麻痹(Thyrotoxic periodic paralysis, TPP)及散發(fā)性周期性麻痹(Sporadic periodic paralysis, SPP)。其中,FPP相關(guān)的報道研究較多。FPP為常染色體顯性遺傳,常見于高加索人群,其致病基因主要為編碼骨骼肌電壓門控通道α1亞單位的CACNAIS (Calcium voltage-gated channel subunit alphal S)基因以及編碼鈉通道α亞單位的SCN4A (Sodium voltage-gated channel alpha subunit 4)基因。而TPP與SPP由于較為罕見,到目前為止,其致病基因和發(fā)病機(jī)制尚不明確,仍有待研究。近年來,TPP與SPP患者數(shù)量在亞洲人群,尤其是我國,呈現(xiàn)遞增態(tài)勢,因此,對這兩類疾病的臨床及致病機(jī)制研究對我國相關(guān)神經(jīng)肌肉病有較高的臨床指導(dǎo)意義。TPP是甲亢患者的神經(jīng)肌肉并發(fā)癥,在甲亢患者中的發(fā)病率約占3%-7%,部分甲亢患者的首發(fā)表現(xiàn)和就診原因也可為周期性麻痹。該病在亞洲國家的青年男性多見,特別是在我國的青年男性人群中發(fā)病率相對較高。TPP以反復(fù)發(fā)作的肢體無力或癱瘓為主要臨床特征,多發(fā)作于清晨�；颊呖杀憩F(xiàn)為發(fā)作性上下肢及軀干的遲緩性癱瘓,同時伴有肌肉電興奮性和腱反射的消失。TPP患者同時具有甲狀腺功能亢進(jìn)的臨床癥狀和體征,如體重下降、心動過速、甲狀腺腫大、震顫及眼征等,可由Graves'病、橋本氏甲狀腺炎等引起。TPP發(fā)作時,患者的血鉀水平可有不同程度的降低,嚴(yán)重時血鉀水平可低于2mmol/L,危險性極高。在甲狀腺毒癥未被控制的情況下,預(yù)防性的補(bǔ)鉀治療不能夠有效阻止肌無力的發(fā)生,但在發(fā)作期補(bǔ)鉀治療則具有明顯的療效。SPP患者為散發(fā)病例,無家族史且甲狀腺功能正常,也主要發(fā)生于亞洲的青年男性,且在我國具有相對較高的發(fā)病率。臨床特征與FPP相似,為反復(fù)發(fā)作的肢體無力或癱瘓,伴有不同程度的血鉀水平降低。常于清晨或下午發(fā)病,可由一側(cè)下肢輕度無力逐漸累及至四肢,一般情況下呼吸肌及心肌不受累。多數(shù)患者的肌無力癥狀能自行緩解,但部分可呈進(jìn)展性發(fā)展并致永久性肌肉損害。其發(fā)作還與多種誘因有關(guān),如高糖飲食、感冒、久坐或者運(yùn)動后等。目前,對于緩解SPP發(fā)作期的癥狀,補(bǔ)鉀治療效果較為顯著。在本項(xiàng)研究中,我們主要收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科及內(nèi)分泌科前來就診的TPP和SPP患者病例,總結(jié)并探討其臨床特點(diǎn)及相關(guān)輔助檢查的特異性,為疾病認(rèn)知及治療提供理論依據(jù)。同時為深入探討TPP和SPP的發(fā)病機(jī)制,我們對上述兩種疾病進(jìn)行分子遺傳學(xué)研究,研究其相關(guān)致病基因等,為進(jìn)一步探索兩種疾病的病理發(fā)生過程提供頗具意義的研究基礎(chǔ)以及新的研究思路。第一部分甲狀腺毒性周期性麻痹與散發(fā)性周期性麻痹的臨床特點(diǎn)分析及KCNJ18基因的突變篩查TPP和SPP的臨床表現(xiàn)與FPP極為相似,因此,既往對該兩種疾病遺傳方面的研究多針對與FPP致病有關(guān)的基因。已有研究報道,6.6%的臺灣SPP患者與CACNA1S基因突變R669H、R1135H和R1239H相關(guān),1%的中國大陸SPP患者與CACNA1S基因突變R672C相關(guān)。而在TPP患者中,僅發(fā)現(xiàn)一例與SCN4A基因突變F671S相關(guān)。2010年Ryan等首次發(fā)現(xiàn)KCNJ18(Potassium voltage-gated channel subfamily J member 18)新基因與TPP相關(guān),該基因編碼肌纖維上的內(nèi)向整流鉀通道Kir2.6(Inwardly rectifying potassium channel 2.6)。Kir2.6為Kir2家族的一員,能夠在維持鉀離子平衡電位和調(diào)節(jié)細(xì)胞興奮性等方面發(fā)揮重要作用。Ryan等研究表明,在高加索TPP患者中,KCNJ18基因突變比例為33%。Cheng等研究發(fā)現(xiàn),在臺灣TPP患者中,KCNJ18基因的突變比例僅為1.67%,并首次報道該基因突變與臺灣SPP患者相關(guān),比例為3.3%。而在我國南方地區(qū)的TPP患者中,KCNJ18基因的突變比例為7%,但我國SPP患者是否與此基因突變具有相關(guān)性尚需進(jìn)一步的研究。此外,相關(guān)病例樣本數(shù)擴(kuò)大可為其致病性研究提供一定的研究基礎(chǔ)。本項(xiàng)研究根據(jù)TPP和SPP臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)為入組條件,選取2010-2013年于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科和內(nèi)分泌科就診的116例患者作為研究對象,其中,TPP患者31例,SPP患者85例；對所有患者均進(jìn)行詳細(xì)的臨床資料、輔助檢查及相關(guān)治療的采集及統(tǒng)計；同時,對所有患者血樣均提取DNA并進(jìn)行KCNJ18基因測序分析。TPP患者均為男性,起病年齡為20至40歲之間,首次發(fā)作均表現(xiàn)為四肢癱瘓,93.6%的TPP患者發(fā)作時血鉀濃度為1.5-2.5 mmol/L,發(fā)作時間多為夜間或清晨睡眠醒來時,每次發(fā)作時間不超過24小時,其中有25例患者已有2次肌無力發(fā)作,6例患者有3次及3次以上發(fā)作。每次發(fā)作均伴有甲狀腺功能亢進(jìn)。23例TPP患者在首次肌無力發(fā)作時才被診斷為患有甲狀腺功能亢進(jìn)癥。其中,27例患者被診斷為Grave's病,4例為亞急性甲狀腺炎。所有TPP患者在糾正其甲狀腺功能亢進(jìn)后,肌無力發(fā)作得到有效地緩解及預(yù)防。同時,在發(fā)作期,患者的補(bǔ)鉀治療效果顯著。而在收集的SPP患者中,2例為女性患者。SPP起病年齡為16-37歲,68.2%的SPP患者發(fā)作時血鉀濃度為1.6-2.5 mmol/L,每次發(fā)作持續(xù)數(shù)小時至數(shù)天不等,肌無力癥狀表現(xiàn)不一。其中有10例患者已有2次肌無力發(fā)作,75例患者有3次及3次以上發(fā)作。SPP在發(fā)作期補(bǔ)鉀治療效果明顯。KCNJ18基因測序分析結(jié)果顯示,一例SPP患者的KCNJ18基因3號外顯子存在新雜合點(diǎn)突變c.505GC,由精氨酸代替甘氨酸(p.G169R)。該患者為34歲男性,17歲起病,第一次發(fā)作表現(xiàn)為晨起四肢癱瘓,呼吸肌不受累。血鉀為1.8mmol/L, CK為1964IU/L,心電圖檢查無異常�；颊呶茨芙邮苎a(bǔ)鉀治療,并在大約24小時后,癥狀開始緩解。此外,肌電圖運(yùn)動誘發(fā)實(shí)驗(yàn)(Exercise test, ET)檢測結(jié)果為,與在靜息時測得的結(jié)果相比,患者在5分鐘持續(xù)運(yùn)動后即刻測得的復(fù)合肌肉動作電位(Compound muscle action potential, CMAP)的波幅增長了約21%,而在運(yùn)動后1小時CMAP的波幅降低了約64%,符合周期性麻痹的診斷。第二部分Kir2.6突變蛋白的功能缺陷驗(yàn)證及其相關(guān)致病機(jī)制的研究已有報道表明,在中國TPP患者中存在4例KCNJ18基因相關(guān)突變,p.Q126X,p.K360T, p.E388K及p.A200P,其中,A200P突變型Kir2.6通道已驗(yàn)證為不具備內(nèi)向整流鉀通道功能,而p.Q126X,p.K360T與p.E388K則為首次報道的新突變,這些突變型通道電生理特性的改變尚需進(jìn)一步的研究探索。我們的研究發(fā)現(xiàn)KCNJ18基因突變同樣與SPP致病相關(guān),提示此基因相關(guān)突變對于TPP和SPP的發(fā)生可能具有相同的致病機(jī)制。本項(xiàng)研究在體外實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證了上述4種Kir2.6突變通道的電生理功能缺陷。本項(xiàng)研究以pEFGP-C3為模板,在體外構(gòu)建pEGFP-Kir2.6野生型質(zhì)粒,并在此基礎(chǔ)上誘導(dǎo)為pEGFP-Q126X、pEGFP-G169R、pEGFP-K360T及pEGFP-E388K突變型質(zhì)粒。通過轉(zhuǎn)染至COS-7細(xì)胞中以檢測通道蛋白的表達(dá)分布,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與野生型相比,Q126X、G169R、K360T及E388K突變蛋白均分布在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜上。經(jīng)轉(zhuǎn)染至人胚胎腎(Human embryo kidney,HEK) 293細(xì)胞中,我們運(yùn)用膜片鉗技術(shù)檢測Kir2.6突變通道介導(dǎo)的鉀離子全細(xì)胞電流變化。Q126X與K360T突變通道的電流密度與非轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比無明顯差異,表明這兩種通道可能不具備內(nèi)向整流功能。而與野生型通道相比,在電壓為-60mV時,G169R和E388K通道的內(nèi)向電流密度分別減小了65.6%及29.9%;而在電壓為0 mV時,其外向電流密度分別減小了84.7%及62.7%。為了模擬患者體內(nèi)突變通道的雜合突變形式,我們分別將pEGFP-Q126X、 pEGFP-G169R, pEGFP-K360T及pEGFP-E388K突變型質(zhì)粒分別以質(zhì)量1：1等比例與野生型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞以檢測電流變化。與野生型相比,在內(nèi)向電壓-60mV與外向電壓0mV時,Q126X雜合型通道的電流密度分別減少了65.7%及91.4%；G169R雜合型通道的電流密度分別減少了48.2%及47.4%；K360T雜合型通道的電流密度分別減少了55.1%及54.3%；而E388K雜合型通道的電流密度分別減少了24.1%及41.1%,提示突變通道亞單位對野生型通道亞單位具有明顯的負(fù)性效應(yīng)。第三部分MicroRNA對周期性麻痹調(diào)控作用的分析MicroRNA(miRNA)是一類序列高度保守的內(nèi)源性非編碼小RNA分子。成熟miRNA通過與靶基因3’端非編碼區(qū)結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá),廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化、免疫系統(tǒng)、凋亡、個體發(fā)育以及機(jī)體代謝等一系列生命過程。而特異性表達(dá)于骨骼肌成肌細(xì)胞及肌管中的miRNAs則定義為myomiRs (Myogenic microRNA)。多項(xiàng)研究報道,myomiRs已被證實(shí)參與肌肉生長發(fā)育的主要過程,如肌發(fā)生、肌纖維分化、肌肉生長及調(diào)節(jié)肌肉的內(nèi)環(huán)境以應(yīng)對外環(huán)境的刺激等。已有研究證實(shí),在多種原發(fā)性及繼發(fā)性肌肉病中,myomiRs的表達(dá)水平可有不同相關(guān)性變化。本項(xiàng)研究選取3例經(jīng)臨床診斷為SPP并行肌肉組織病理檢查的患者為SPP組,同時選取3例因肌無力行肌肉組織病理檢查,但實(shí)驗(yàn)室檢查和肌肉病理診斷為大致正常的個體作為對照組。應(yīng)用Afymetrix miRNA 4.0芯片技術(shù)篩選該兩組肌肉組織標(biāo)本差異性表達(dá)的miRNA分子,芯片結(jié)果顯示21種miRNAs分子表達(dá)存在明顯差異,其中16種miRNAs分子在SPP組表達(dá)下調(diào),而5種miRNAs分子在SPP組表達(dá)上調(diào)。我們根據(jù)芯片結(jié)果及相關(guān)參考文獻(xiàn)共挑選了4個可能與SPP發(fā)病相關(guān)的miRNAs,miRNA-181d、miRNA-34a、miRNA-122、miRNA-27b,進(jìn)一步利用TaqMan探針實(shí)時定量PCR (Real-time PCR)的方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示,上述4種miRNA分子在患者組中較對照組表達(dá)明顯下調(diào),與芯片結(jié)果一致,推測miRNA分子可能參與SPP的致病過程。綜上所述,本項(xiàng)研究對一大組116例TPP和SPP患者的KCNJ18基因進(jìn)行序列分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在一例SPP患者中存在一個新雜合點(diǎn)突變c.505GC,導(dǎo)致氨基酸由甘氨酸變?yōu)榫彼?p.G169R),其長時運(yùn)動誘發(fā)試驗(yàn)結(jié)果符合周期性麻痹的表現(xiàn)；應(yīng)用膜片鉗技術(shù)對我們新發(fā)現(xiàn)的SPP相關(guān)突變(p.G169R),以及以往報道的3個中國人群TPP相關(guān)突變(p.Q126X、p.K360T和p.E388K)進(jìn)行電生理功能驗(yàn)證,電生理檢測結(jié)果表明,突變型Kir2.6通道的鉀離子電導(dǎo)性明顯減弱,且突變通道亞單位對野生型通道亞單位具有明顯的負(fù)性效應(yīng)；SPP組與對照組肌肉miRNA芯片檢測結(jié)果提示,miRNA可能參與SPP相關(guān)致病過程。這些研究結(jié)果為了解TPP與SPP的致病原因提供了頗具意義的研究參考,此外,還為進(jìn)一步明確兩種疾病的發(fā)生過程提供了新的研究思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R746.3
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本文編號：2509406