【摘要】：膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system, CNS）最常見的腫瘤，惡性膠質(zhì)瘤約占全部顱內(nèi)腫瘤的50%，約占所有惡性腫瘤的2%，惡性膠質(zhì)瘤的年發(fā)病率約為5/10萬人。世界衛(wèi)生組織（world health organization,WHO）根據(jù)CNS腫瘤的分化將其分為I-IV級，其中I-II屬于低級別膠質(zhì)瘤（low-grade gliomas, LGG），III-IV屬于高級別膠質(zhì)瘤（high-grade gliomas,HGG），WHO根據(jù)CNS腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分化將膠質(zhì)瘤分為星形細(xì)胞瘤、少支膠質(zhì)細(xì)胞瘤和混合性少支-星形細(xì)胞瘤等。積極治療膠質(zhì)瘤的常用方法包括手術(shù)切除、放射治療和化學(xué)治療。手術(shù)切除作為最常用的治療方法,目的在于明確病理診斷、減少腫瘤細(xì)胞數(shù)量、改善患者癥狀從而延長患者的生存時間。采用手術(shù)切除、放射治療和化學(xué)治療后依然復(fù)發(fā)的HGG預(yù)后很差，III級和IV級膠質(zhì)瘤的中位存活期分別為39周和30周。HGG因腫瘤惡性程度高，術(shù)后容易復(fù)發(fā)，因此需要我們找到一種更為安全有效的治療方法，盡可能阻止惡性膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)，延長患者生存時間。 膠質(zhì)瘤作為腫瘤疾病的一種，其治療難點在于如何徹底治愈腫瘤。單獨的手術(shù)治療往往難以根治腫瘤，尤其是惡性度高的HGG。其原因是腫瘤細(xì)胞呈浸潤性彌漫性生長，在術(shù)中很難用肉眼區(qū)分惡性腫瘤與正常組織。與正常細(xì)胞的有限復(fù)制能力相比，腫瘤細(xì)胞和干細(xì)胞具有無限復(fù)制的潛能，這種特點就意味著腫瘤細(xì)胞和干細(xì)胞可以無限增殖，腫瘤干細(xì)胞（cancerstem cell, CSC）可能是腫瘤發(fā)生、復(fù)發(fā)和耐藥的原因。CSC是指具有自我更新能力并且產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的特殊腫瘤亞群。CSC可以長期處于休眠狀態(tài)中并且具有多種耐藥分子從而提高腫瘤的耐藥性，致使很多抗腫瘤藥物對腫瘤的治療療效較差。從人類各種腫瘤中均可發(fā)現(xiàn)CSC，例如血液、乳腺、腦、骨、皮膚、肝臟、前列腺、卵巢、膀胱、直腸和胰腺。 鹽霉素是從白色鏈霉菌分離出來的一元羧聚醚離子載體。它具有親脂性，是一種陰離子帶有弱酸的復(fù)合物。鹽霉素可以作用在細(xì)胞質(zhì)膜和線粒體膜等多種生物膜上，并且作為具有嚴(yán)格選擇性的離子載體，，對于堿性離子和鉀離子有很好的選擇性，可以提高線粒體和細(xì)胞鉀離子的外流和抑制線粒體氧化磷酸化反應(yīng)。鹽霉素具有很好的抗微生物活性，可以有效抵抗革蘭氏陰性細(xì)菌。鹽霉素作為一種抗腫瘤藥物不僅可以作用在多種腫瘤細(xì)胞上并且可以作為一種靶向藥物直接作用在CSC上。鹽霉素與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用還具有協(xié)同作用，所以鹽霉素是一種非常具有前景的抗腫瘤藥物。為此，本研究在體外實驗中采用鹽霉素聯(lián)合應(yīng)用其它抗腫瘤藥物的方法治療膠質(zhì)瘤細(xì)胞，并通過檢測衰老細(xì)胞進(jìn)一步驗證這種聯(lián)合用藥的方法是否可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長和復(fù)發(fā)。 目的：在體外實驗中測量出需要殺死全部膠質(zhì)瘤細(xì)胞并且不再復(fù)發(fā)的甲萘醌、維生素C與鹽霉素聯(lián)合應(yīng)用的最低有效濃度和作用時間。方法：（1）通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在DBTRG-05MG、hGCL-9、hGCL-10和hGCL-12膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中采用短期實驗測量甲萘醌、維生素C與鹽霉素的聯(lián)合用藥效果。在甲萘醌和維生素C聯(lián)合用藥區(qū)域中分組如下：①組加入無菌蒸餾水5μl+二甲基亞砜（dimethylsulfoxide, DMSO）5μl+完全培養(yǎng)基（complete medium,CM）5μl；②組加入1μM甲萘醌5μl+0.1mM維生素C5μl+CM5μl；③組加入2.5μM甲萘醌5μl+0.25mM維生素C5μl+CM5μl；④組加入5μM甲萘醌5μl+0.5mM維生素C5μl+CM5μl；⑤組加入10μM甲萘醌5μl+1.0mM維生素C5μl+CM5μl；⑥組加入25μM甲萘醌5μl+2.5mM維生素C5μl+CM5μl。在甲萘醌、維生素C與鹽霉素（0.5μM）聯(lián)合用藥區(qū)域中分組如下：①組加入無菌蒸餾水5μl+DMSO5μl+0.5μM鹽霉素5μl；②組加入1μM甲萘醌5μl+0.1mM維生素C5μl+0.5μM鹽霉素5μl；③組加入2.5μM甲萘醌5μl+0.25mM維生素C5μl+0.5μM鹽霉素5μl；④組加入5μM甲萘醌5μl+0.5mM維生素C5μl+0.5μM鹽霉素5μl；⑤組加入10μM甲萘醌5μl+1.0mM維生素C5μl+0.5μM鹽霉素5μl；⑥組加入25μM甲萘醌5μl+2.5mM維生素C5μl+0.5μM鹽霉素5μl。在甲萘醌、維生素C與鹽霉素（1.0μM）聯(lián)合用藥區(qū)域中分組如下：①組加入無菌蒸餾水5μl+DMSO5μl+1.0μM鹽霉素5μl；②組加入1μM甲萘醌5μl+0.1mM維生素C5μl+1.0μM鹽霉素5μl；③組加入2.5μM甲萘醌5μl+0.25mM維生素C5μl+1.0μM鹽霉素5μl；④組加入5μM甲萘醌5μl+0.5mM維生素C5μl+1.0μM鹽霉素5μl；⑤組加入10μM甲萘醌5μl+1.0mM維生素C5μl+1.0μM鹽霉素5μl；⑥組加入25μM甲萘醌5μl+2.5mM維生素C5μl+1.0μM鹽霉素5μl。細(xì)胞在96孔板中種板并且貼壁生長過夜后，在不同的聯(lián)合用藥區(qū)域中加藥和培養(yǎng)72小時后再加入CCK-8檢測細(xì)胞存活情況。本實驗使用酶標(biāo)儀后用Thermo Scientific Ascent software v.2.6程序測試出光吸收值，細(xì)胞活力用每個實驗組與正常對照組的吸光值的比值表示，數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，最后制作成圖表可以直觀的了解不同抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用和在不同聯(lián)合用藥濃度下對細(xì)胞存活的影響。（2）在4個膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中分別進(jìn)行長期實驗測定殺死全部腫瘤細(xì)胞的最低有效濃度和作用時間。加入抗腫瘤藥物100μl時間不同，最長時間為2周（培養(yǎng)液和藥物每周更換2次）。隨后細(xì)胞在沒有藥物的培養(yǎng)基（每周更換2次）中用顯微鏡觀察是否復(fù)發(fā)4周。根據(jù)加藥時間不同分為4組，4個組加藥時間分別為3天、7天、10天、14天。每一組又有3種不同濃度的抗腫瘤藥聯(lián)合應(yīng)用，濃度分別為：①甲萘醌2.5μM+維生素C0.25mM+鹽霉素0.5μM；②甲萘醌5.0μM+維生素C0.5mM+鹽霉素0.5μM；③甲萘醌7.5μM+維生素C0.75mM+鹽霉素0.5μM。（3）將腫瘤細(xì)胞在小培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)后加入制備好的衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色劑中染色，在熒光顯微鏡下觀察染色情況。衰老實驗分為4個組，一個不加入藥物的對照組和3個實驗組：①甲萘醌2.5μM+維生素C0.25mM+鹽霉素0.5μM；②甲萘醌5.0μM+維生素C0.5mM+鹽霉素0.5μM；③甲萘醌7.5μM+維生素C0.75mM+鹽霉素0.5μM。結(jié)果：（1）采用甲萘醌、維生素C與鹽霉素聯(lián)合治療膠質(zhì)瘤的效果顯著，藥物濃度低于采用甲萘醌與維生素C的聯(lián)合用藥的方式。DBTRG-05MG細(xì)胞系與hGCL-9、hGCL-10和hGCL-12細(xì)胞有相似的結(jié)果。（2）在4個膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中甲萘醌、維生素C與鹽霉素在濃度分別為7.5μM:0.75mM:0.5μM時加藥7天具有殺死所有膠質(zhì)瘤細(xì)胞的能力并且可以在沒有藥物治療的4周內(nèi)不再復(fù)發(fā)。在hGCL-9和hGCL-10兩個細(xì)胞系中聯(lián)合用藥時濃度為5.0μM:0.5mM:0.5μM的較低濃度組中用藥10天也可以殺死所有的膠質(zhì)瘤細(xì)胞并且在沒有藥物的環(huán)境下不再復(fù)發(fā)。（3）通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),衰老實驗中沒有治療的膠質(zhì)瘤細(xì)胞幾乎沒有變色，而經(jīng)過治療后的腫瘤細(xì)胞則被染成藍(lán)色。結(jié)論：（1）采用甲萘醌、維生素C與鹽霉素聯(lián)合用藥可以有效的治療膠質(zhì)瘤。（2）選用RC0作為長期實驗的終止參數(shù),可以得到殺死所有腫瘤細(xì)胞的有效濃度和作用時間，并且進(jìn)行長期實驗可以觀察腫瘤復(fù)發(fā)情況。（3）采用甲萘醌、維生素C與鹽霉素聯(lián)合用藥的全新方式可以成功誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞衰老，衰老的細(xì)胞失去繁殖能力，從而抑制腫瘤的生長和復(fù)發(fā)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41

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本文編號：2508179