【摘要】：研究背景 蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是由腦底部或腦表面的病變血管破裂，血液直接流入蛛網(wǎng)膜下腔引起的一種臨床綜合征。流行病學(xué)調(diào)查顯示，SAH約占急性腦卒中的10%左右,大多數(shù)蛛網(wǎng)膜下腔出血是由動(dòng)脈瘤破裂導(dǎo)致的。動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血是一種極其危重的疾病，其致殘率和致死率都很高。蛛網(wǎng)膜下腔出血主要的患病人群是40-60歲的中老年人。每年的發(fā)病率大約是10/100,000，其中有12%的SAH患病人群在進(jìn)入醫(yī)院接受治療之前死亡，另外有40%的SAH患者在入院治療1個(gè)月內(nèi)死亡。在所有幸存下來(lái)的SAH患者中約30%會(huì)遺留嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙，導(dǎo)致生活不能自理。50%的患者在較長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)伴有認(rèn)知功能障礙，而且這種認(rèn)知障礙幾乎不可能恢復(fù)到病前水平。雖然SAH的診斷技術(shù)和外科治療措施有了很大提高和改進(jìn)，但是SAH患者的臨床預(yù)后仍然不理想。目前為止，研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致SAH患者高致殘率和高致死率的主要因素是腦血管痙攣(cerebral vasospasm,CVS)和早期腦損傷(earlybrain injury,EBI).。CVS在SAH后的第1天出現(xiàn)，在SAH后6-8天達(dá)到高峰，并持續(xù)2-3周。CVS是SAH最常見(jiàn)的高危并發(fā)癥，常可繼發(fā)嚴(yán)重的腦組織缺血，進(jìn)而出現(xiàn)遲發(fā)性腦缺血，導(dǎo)致患者遺留嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙，甚至是死亡。以往一直認(rèn)為CVS是導(dǎo)致SAH患者死亡率高和預(yù)后不良的主要原因，所以數(shù)十年來(lái)，研究者們將重點(diǎn)放在了CVS上，但是針對(duì)這些機(jī)制的治療措施并沒(méi)有明顯改善SAH患者的預(yù)后。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，SAH后EBI也與患者的長(zhǎng)期不良預(yù)后有關(guān)，EBI是SAH后的前72小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)的腦組織的損傷，有學(xué)者提出一個(gè)挑戰(zhàn)性的觀點(diǎn)：EBI對(duì)SAH預(yù)后的影響比CVS大。EBI的病理生理機(jī)制包括由顱內(nèi)壓的急劇增加和腦灌注壓的急劇下降導(dǎo)致的彌漫性的腦缺血損傷，細(xì)胞凋亡的激活，血腦屏障的破壞，腦水腫和免疫炎癥反應(yīng)等。在深入理解SAH后CVS及EBI的發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)上，尋找出安全、有效、易于實(shí)施的防治措施是改善SAH患者預(yù)后的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。雖然長(zhǎng)期以來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)SAH后CVS及EBI的研究投入了大量人力和物力，然而迄今為止仍然缺乏切實(shí)有效的防治手段。 近幾年的研究發(fā)現(xiàn)由活化的免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)在許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著重要的作用。國(guó)內(nèi)外學(xué)者的大量研究顯示SAH后痙攣的腦動(dòng)脈壁和腦實(shí)質(zhì)中存在顯著而持續(xù)的免疫炎癥反應(yīng)。在腦動(dòng)脈瘤破裂發(fā)生SAH后，血液進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔并裂解釋放出血紅蛋白、膽紅素等物質(zhì)從而激活免疫炎癥系統(tǒng)。SAH后腦動(dòng)脈壁中有中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其它免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，免疫球蛋白及補(bǔ)體沉積，以及血管內(nèi)皮發(fā)生腫脹與變性凋亡、血管中膜及外膜增厚等炎癥表現(xiàn)，上述變化與CVS發(fā)生的時(shí)相及遲發(fā)性缺血性神經(jīng)功能損害相一致。而且，在SAH大鼠腦組織中，許多與免疫炎癥相關(guān)的基因及其產(chǎn)物發(fā)生了明顯的變化。雖然具有許多潛在的副作用，旨在以減輕免疫炎癥反應(yīng)為目標(biāo)的干預(yù)藥物如類固醇激素、免疫抑制劑等對(duì)SAH后CVS及EBI顯示出了肯定的效果。因此，免疫炎癥反應(yīng)是蛛網(wǎng)膜下腔出血后CVS及EBI有前景的治療靶點(diǎn)。抑制過(guò)度免疫反應(yīng)和炎性細(xì)胞激活、浸潤(rùn)及炎性細(xì)胞因子等的產(chǎn)生有望成為防治SAH后CVS及EBI的新的有效途徑。 研究目的 1.探討調(diào)節(jié)性T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)輸對(duì)SAH后腦血管痙攣的緩解作用。 2.探討調(diào)節(jié)性T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)輸在SAH后早期腦損傷中的保護(hù)作用。 3.觀察調(diào)節(jié)性T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)輸對(duì)SAH后細(xì)胞損傷、凋亡及其相關(guān)因子的影響，以確定調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)SAH后腦損傷保護(hù)的有關(guān)分子機(jī)制。 從利用具有免疫抑制作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)SAH大鼠模型進(jìn)行干預(yù)的方法中尋找可以治療或改善SAH患者預(yù)后的藥物。 研究方法 1.選擇健康成年Wistar大鼠，雌雄各半，體重在300-350g之間，，隨機(jī)將大鼠分成假手術(shù)組、SAH+PBS處理組、SAH+脾細(xì)胞（spleen cells，SP）處理組、SAH+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)治療組。選擇經(jīng)股靜脈輸注的方法對(duì)SAH+PBS處理組、SAH+SP處理組、SAH+Treg治療組這三個(gè)組的動(dòng)物模型進(jìn)行治療干預(yù)。 2.對(duì)上述分組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在模型制作前及枕大池二次注血后6小時(shí)和12小時(shí)時(shí)用激光多普勒血流計(jì)動(dòng)態(tài)測(cè)量動(dòng)物頂葉皮層局部腦血流量（regional cerebral bloodflow,rCBF）；于SAH后2天時(shí)，經(jīng)心臟灌注固定后分離出大鼠腦干做成冰凍切片，通過(guò)H-E染色法染色，在顯微鏡下觀察基底動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化，測(cè)定并比較各組大鼠模型基底動(dòng)脈內(nèi)外徑和管壁厚度的變化。 3.對(duì)上述分組動(dòng)物，在SAH后2天時(shí)，留取大鼠新鮮的大腦皮層腦組織并提取蛋白，用Western blot法檢測(cè)大腦皮層中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetalloproteinases-9，MMP-9)的表達(dá)水平；于SAH后2天時(shí)，用干濕重法測(cè)定并比較各組大鼠腦組織的含水率。 4.在SAH后2天時(shí)，對(duì)腦組織切片行尼氏染色，用顯微測(cè)量尺測(cè)量海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞密度；用末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP末端缺口標(biāo)記法(Terminal deoxynuleotidyl transferase-mediated Dutp-biotin nick end-labaling，TUNEL)檢測(cè)各組大鼠大腦皮層中的原位神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，對(duì)凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)并比較各組大鼠大腦皮層凋亡細(xì)胞數(shù)目的差異；用免疫熒光法檢測(cè)并比較各組大鼠大腦皮層中activecaspase-3陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)的差異；通過(guò)western blot法檢測(cè)大腦皮層中activecaspase-3的表達(dá)水平。 研究結(jié)果 1.（1）除假手術(shù)組之外， SAH+PBS組、SAH+SP組、SAH+Tregs組大鼠模型制作之后6h和12h時(shí)頂葉皮層的rCBF均較模型制作之前的rCBF顯著減少(p0.01)，其中以SAH后PBS治療組和SP治療組最為明顯，SAH后靜脈輸注Tregs治療組的rCBF較另外兩個(gè)治療組顯著改善(p0.05)。（2）SAH+PBS處理組、SAH+SP處理組、SAH+Tregs治療組比假手術(shù)組的基底動(dòng)脈明顯痙攣縮窄、管壁增厚(p0.05)，SAH+Tregs治療組模型又比前兩個(gè)治療組的基底動(dòng)脈管徑顯著增大，管壁變薄(p0.01)。 2.（1）干濕重法測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)SAH+PBS處理組、SAH+SP處理組、SAH+Tregs治療組腦組織含水率較假手術(shù)組大鼠腦組織的含水率顯著增加(p0.05),Tregs細(xì)胞治療組又比PBS處理組和SP處理組大鼠腦組織的含水率明顯減少(p0.05)；（2）Westernblot測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，SAH+PBS處理組、SAH+SP處理組、SAH+Tregs治療組MMP-9的表達(dá)量均顯著增加(p0.05)，而SAH+Tregs治療組中該蛋白酶的表達(dá)量較SAH+PBS處理組、SAH+SP處理組明顯減少(p0.05)。 3.（1）在SAH后2天，尼氏染色發(fā)現(xiàn)SAH+PBS處理組、SAH+SP處理組、SAH+Tregs治療組大鼠海馬CA1區(qū)正常椎體細(xì)胞密度較假手術(shù)組顯著減小(p0.05)，SAH+Tregs治療組大鼠海馬CA1區(qū)的正常椎體細(xì)胞密度較SAH+PBS處理組、SAH+SP處理組明顯增大(p0.05)；（2）TUNEL染色法發(fā)現(xiàn)SAH后，SAH+PBS處理組、SAH+SP處理組、SAH+Tregs治療組大鼠大腦皮層中的凋亡細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組顯著增多(p0.05),SAH+Tregs治療組中凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少(p0.05)；（3）通過(guò)免疫熒光法發(fā)現(xiàn)SAH+PBS處理組、SAH+SP處理組、SAH+Tregs治療組大鼠大腦皮層中表達(dá)active caspase-3的細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組大鼠模型大腦皮層中active caspase-3的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加（p0.05），SAH+Tregs治療組大鼠大腦皮層中active caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較SAH+PBS處理組、SAH+SP處理組明顯減少（p0.05）。（4）western blot法發(fā)現(xiàn)SAH+PBS處理組、SAH+SP處理組、SAH+Tregs治療組大鼠大腦皮層中activecaspase-3的表達(dá)水平較假手術(shù)組大鼠大腦皮層中active caspase-3的表達(dá)水平顯著增加（p0.01），SAH+Tregs治療組大鼠模型大腦皮層中active caspase-3的表達(dá)水平較SAH+PBS處理組和SAH+SP處理組大鼠大腦皮層中active caspase-3的表達(dá)水平明顯減少（p0.05）。 研究結(jié)論 1.調(diào)節(jié)性T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)輸可以緩解SAH后腦血管痙攣的程度和基底動(dòng)脈的病理變化程度。 2.調(diào)節(jié)性T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)輸可以減輕SAH后腦水腫的程度，減少SAH后MMP-9的表達(dá)。 3.調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的過(guò)繼轉(zhuǎn)輸通過(guò)調(diào)節(jié)active caspase-3的表達(dá)而抑制SAH后腦組織細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：泰山醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R743

【參考文獻(xiàn)】

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1 李小明,孫志賢;細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白酶—Caspase-3[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊(cè));1999年01期

2 趙菲;李世擁;安萍;于波;蔡慧云;;FasL誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)對(duì)直腸癌細(xì)胞侵襲行為的影響[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2008年05期

3 劉麗華,韓毅力,白羽;死亡受體介導(dǎo)的凋亡和肝臟疾病[J];醫(yī)學(xué)綜述;2005年10期

本文編號(hào)：2505887