【摘要】：研究背景 隨著科技進步和生活節(jié)奏的加快，人們面臨各個方面的應激原，經(jīng)常處于心理應激狀態(tài)。適度的應激會對機體起到一定的保護作用，而過度的應激則會誘發(fā)心理、生理平衡的失調(diào)，從而誘發(fā)某些疾病，應激防護已成為當今研究的熱點課題。課題組前期發(fā)現(xiàn)心理應激會導致機體部分腦區(qū)鐵蓄積，而腦鐵蓄積則會誘發(fā)細胞氧化應激損傷和誘導細胞死亡等。已有研究證明腦鐵過多與多種中樞神經(jīng)退行性病變密切相關，如帕金森氏病、阿爾茨海默病等。但目前為止，應激導致部分腦區(qū)鐵蓄積的機制尚未完全闡明。 機體的鐵以兩種形式存在，即無機鐵和蛋白結(jié)合鐵。蛋白結(jié)合鐵包括鐵蛋白結(jié)合鐵、鐵血黃素鐵和含鐵酶類等，其中主要是與血紅素結(jié)合的鐵。目前，無機鐵的攝取和轉(zhuǎn)運已基本清楚，但血紅素的攝取還未完全明確。細胞除自身合成鐵以外，是否可以通過增加血紅素的攝取而增加細胞內(nèi)鐵含量還不完全清楚。但血紅素過多對細胞是有潛在毒性的。據(jù)報道，出血性中風患者腦內(nèi)游離的血紅素會增多，血紅素增多與中風后細胞氧化應激損傷甚至凋亡密切相關。 Shayeghi等人認為小腸血紅素鐵的吸收主要是通過血紅素轉(zhuǎn)運蛋白HCP1來完成的，HCP1首先在腸道被發(fā)現(xiàn)的，在肝、腎、腦、及多種細胞上都有表達，最近有學者發(fā)現(xiàn)星型膠質(zhì)細胞也有HCP1的表達，且證明星型膠質(zhì)細胞HCP1具有攝取血紅素鐵的功能。 有意義的是，我課題組前期基因芯片結(jié)果顯示心理應激后大鼠肝臟血紅素轉(zhuǎn)運蛋白HCP1表達異常增高，心理應激大鼠腦內(nèi)HCP1有何變化尚不清楚，應激大鼠部分腦區(qū)鐵含量增加是否與HCP1表達有關尚無報道，本文為闡明此問題進行了研究。 研究目的 觀察心理應激對大鼠部分腦區(qū)HCP1表達及相應腦區(qū)鐵含量的影響，明確海馬神經(jīng)細胞HT-22是否可以通過HCP1攝取血紅素鐵。在此基礎上探討心理應激狀態(tài)下HCP1表達變化機制。 研究方法 1.心理應激對大鼠部分腦區(qū)鐵含量及血紅素轉(zhuǎn)運蛋白HCP1表達的影響 1.1復制大鼠心理應激模型 1.1.1實驗動物分組 雄性成年SD大鼠，體重120g左右。按體重隨機分為空白對照組、心理應激組。動物飼養(yǎng)實驗室環(huán)境溫度24℃左右，濕度50%~60%；使用單籠飼養(yǎng)，自由飲食。 1.1.2方法 參照文獻，復制大鼠心理應激模型。模型由透明樹脂板隔成20個小室。一半?yún)^(qū)域底部絕緣，另一半?yún)^(qū)域底部通電，兩個不同區(qū)域交叉設置。應激組大鼠放在絕緣區(qū)小室，電擊組大鼠放在通電區(qū)，通電后被電擊的大鼠驚叫，跳躍，使周圍的應激組大鼠產(chǎn)生恐懼的心理反應。每天上午9點通電30min,電壓80V左右，共7天。 1.1.3心理應激大鼠血清皮質(zhì)酮(CORT)水平檢測 按照放免試劑盒說明操作。 1.2心理應激對大鼠部分腦區(qū)鐵含量的影響 稱取海馬、皮層、紋狀體組織，用濕式消化法消化，樣本用去離子水精確定容。采用空氣-乙炔火焰原子吸收法測定樣本中鐵含量，根據(jù)標準曲線和組織重量得出相應的測定結(jié)果。單位組織內(nèi)鐵含量用ng/mg組織表示。 1.3心理應激對大鼠部分腦區(qū)血紅素轉(zhuǎn)運蛋白HCP1表達的影響 用Trizol試劑抽提大鼠海馬、皮層、紋狀體總RNA，采用實時定量熒光PCR(RT-PCR)法測定對照組與應激組大鼠海馬、皮層、紋狀體內(nèi)HCP1mRNA表達水平。蛋白免疫印跡方法(Western blot)測定對照組與應激組大鼠海馬、皮層內(nèi)HCP1的含量。 2. HT-22細胞HCP1轉(zhuǎn)運血紅素鐵功能觀察 2.1不同濃度的血紅素鐵對海馬神經(jīng)細胞HT-22鐵含量及細胞活性的影響 細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)液中加入不同濃度的血紅素鐵（0μM、10μM、30μM、50μM）,孵育不同時間（2h、4h、6h）。用CCK-8試劑盒檢測不同濃度血紅素鐵干預后細胞活性情況。細胞用NaOH裂解后用BCA法測細胞總蛋白，原子吸收分光光度計測量細胞內(nèi)總鐵含量。單位細胞內(nèi)鐵含量即細胞內(nèi)總鐵含量與蛋白含量的比值，用nmol/mg蛋白表示。 2.2鋅卟啉代替血紅素鐵進一步觀察HT-22細胞HCP1的攝取血紅素鐵功能 干預組細胞加入鋅卟啉30μM，2小時后洗滌細胞，用甲醛固定30分鐘后，加入抗熒光淬滅劑，后通過熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)鋅卟啉自發(fā)熒光情況。 3.應激狀態(tài)引起大鼠部分腦區(qū)HCP1表達變化的機制研究 3.1觀察心理應激對大鼠部分腦區(qū)HCP1轉(zhuǎn)錄因子表達的影響 研究發(fā)現(xiàn)KLF4、NRF1、YY1、CDX2等轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控腸細胞HCP1的表達，但心理應激狀態(tài)下,這些轉(zhuǎn)錄因子在腦區(qū)是否起作用不清楚。所以本實驗首先查看心理應激大鼠部分腦區(qū)HCP1轉(zhuǎn)錄因子的表達的變化。用Trizol試劑抽提大鼠海馬、皮層總RNA，采用實時定量熒光PCR法測定大鼠應激后相應組織內(nèi)KLF4、NRF1、YY1、CDX2轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達水平。Western blot法測定對照組與應激組大鼠海馬、皮層內(nèi)KLF4蛋白的含量。 3.2皮質(zhì)酮是否通過KLF4影響HCP1的表達 3.2.1皮質(zhì)酮對HT-22細胞HCP1表達的影響 細胞分對照組和干預組。干預組細胞加入不同濃度的皮質(zhì)酮（0μM、1μM、10μM、15μM、30μM）孵育36h。用CCK-8試劑盒檢測皮質(zhì)酮干預后細胞活性。采用實時定量熒光PCR法測定經(jīng)皮質(zhì)酮干預后細胞內(nèi)HCP1mRNA表達水平。Western blot法測定皮質(zhì)酮干預后細胞內(nèi)HCP1蛋白含量的變化。終濃度30μM的的皮質(zhì)酮對HT-22細胞活性無明顯影響，選定30μM皮質(zhì)酮孵育不同時間（0~36h），同樣的方法檢測細胞內(nèi)HCP1mRNA及蛋白含量。 3.2.2皮質(zhì)酮對HT-22細胞KLF4表達的影響 干預組細胞加入皮質(zhì)酮30μM，孵育不同時間（0~24h）。Western blot法測定細胞內(nèi)KLF4蛋白含量的變化。 3.2.3干擾KLF4后，皮質(zhì)酮對HT-22細胞HCP1表達的影響 由吉瑪公司設計并合成三條KLF4干擾RNA（siRNA）即901、1331、1796和FAM空白對照組序列,分別轉(zhuǎn)染至HT-22細胞,轉(zhuǎn)染48小時后提取細胞RNA，用PCR法檢測細胞內(nèi)對照組和轉(zhuǎn)染組KLF4mRNA的水平，結(jié)果序列1331組KLF4mRNA下降至對照組的10%左右，效果最好。于是將1331序列用同樣的方法轉(zhuǎn)染至細胞內(nèi)，24小時后對照組、干預組均加入皮質(zhì)酮30μM繼續(xù)孵育。采用實時定量熒光PCR法測定細胞內(nèi)HCP1mRNA表達水平。Western blot法測定細胞內(nèi)HCP1蛋白含量的變化。 3.2.4阻斷糖皮質(zhì)激素受體后，皮質(zhì)酮對HT-22細胞HCP1表達的影響 HT-22細胞用終濃度10μM RU486孵育，1h后加入皮質(zhì)酮30μM繼續(xù)孵育24h，Western blot法測定細胞內(nèi)HCP1蛋白含量的變化。 3.3皮質(zhì)酮是否通過KLF4影響HT-22細胞內(nèi)鐵含量 3.3.1皮質(zhì)酮對HT-22細胞內(nèi)鐵含量的影響 a細胞培養(yǎng)同上，干預組細胞經(jīng)30μM皮質(zhì)酮孵育24h后，干預組、對照組均加入30μM血紅素鐵，繼續(xù)孵育0.5h/1h/2h，然后用NaOH溶液裂解細胞后，BCA法測細胞內(nèi)總蛋白，空氣-乙炔火焰原子吸收分光光度計測細胞內(nèi)總鐵含量。 b鋅卟啉代替血紅素鐵進一步觀察皮質(zhì)酮對HT-22細胞內(nèi)鐵含量的影響 細胞培養(yǎng)同上，干預組細胞經(jīng)30μM皮質(zhì)酮孵育24h后，干預組、對照組均加入30μM鋅卟啉，繼續(xù)孵育2h，干預完畢用4%的多聚甲醛固定，在熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)鋅卟啉的自發(fā)熒光情況。 3.3.2干擾KLF4后，皮質(zhì)酮對HT-22細胞內(nèi)鐵含量的影響 細胞培養(yǎng)同上， KLF4干擾效果最好的序列1331轉(zhuǎn)染入干預組細胞，孵育24小時后，對照組、干預組均加入皮質(zhì)酮30μM，繼續(xù)孵育24小時后，干預組、對照組均加入30μM血紅素鐵，繼續(xù)孵育0.5h/1h/2h，然后用NaOH溶液裂解細胞后，BCA法測細胞內(nèi)總蛋白，原子吸收法測細胞內(nèi)總鐵含量。細胞內(nèi)鐵含量即細胞總鐵含量與細胞蛋白含量的比值，用nmol/mg蛋白表示。 4.數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與處理 western條帶采用quantity one圖像分析系統(tǒng)進行灰度分析。兩組間差異采用成組設計資料的t檢驗方法，多組間差異采用One-wayANOVA即單因素方差分析。P 0.05表示差別有統(tǒng)計學意義，P0.01表示非常顯著性差異。P0.001表示極其顯著差異。 結(jié)果 1.心理應激對大鼠部分腦區(qū)鐵含量及HCP1表達的影響 1.1應激組大鼠血清皮質(zhì)酮水平變化 與對照組相比，應激組大鼠體內(nèi)皮質(zhì)酮含量明顯升高（P 0.01）。 1.2心理應激對大鼠部分腦區(qū)鐵含量的影響 與對照組相比，應激組大鼠海馬、皮層、紋狀體內(nèi)鐵含量均有顯著升高（P0.05）。 1.3心理應激對大鼠部分腦區(qū)HCP1表達的影響 實時定量熒光PCR結(jié)果顯示應激組大鼠海馬、皮層、紋狀體內(nèi)HCP1mRNA表達水平比對照組明顯升高。海馬內(nèi)HCP1mRNA表達水平升高大概3倍（P 0.001）、皮層內(nèi)升高約7倍（P 0.001）；Western blot結(jié)果顯示心理應激組大鼠海馬、皮層內(nèi)HCP1蛋白含量顯著升高。 2.海馬神經(jīng)細胞HT-22HCP1轉(zhuǎn)運血紅素鐵功能觀察 與對照組相比，HT-22細胞內(nèi)總鐵含量隨血紅素鐵濃度增大和時間的延長而增加（P 0.01）。熒光顯微鏡圖片顯示細胞經(jīng)鋅卟啉孵育后，細胞內(nèi)有明顯的鋅卟啉聚集。 3.應激狀態(tài)引起HCP1表達變化的機制探討 3.1心理應激對HCP1的轉(zhuǎn)錄因子表達的影響 實時定量熒光PCR結(jié)果顯示應激大鼠海馬、皮層內(nèi)KLF4mRNA顯著增高（P0.01）；Western blot顯示應激組大鼠海馬、皮層內(nèi)KLF4蛋白的含量較對照組比較明顯增高（P 0.01）。其他相關轉(zhuǎn)錄因子的變化無統(tǒng)計學差異（P0.05）。 3.2皮質(zhì)酮是否通過KLF4影響HCP1的表達 3.2.1經(jīng)30μM皮質(zhì)酮孵育后，細胞活性無明顯變化，細胞內(nèi)HCP1mRNA表達水平隨皮質(zhì)酮濃度的增大和時間的延長而明顯增加（P 0.01）；HCP1蛋白含量在8h后明顯增加（P 0.05）。 3.2.2皮質(zhì)酮干預不同時間后，細胞內(nèi)KLF4蛋白水平從2h后顯著增高（P0.05）。 3.2.3用siRNA干擾KLF4后，皮質(zhì)酮對HT-22細胞HCP1的上調(diào)作用被取消（P0.05）。 3.2.4阻斷糖皮質(zhì)激素受體后，皮質(zhì)酮對HT-22細胞HCP1表達無明顯影響（P0.05）。 3.3皮質(zhì)酮是否通過KLF4影響細胞內(nèi)鐵含量 細胞經(jīng)皮質(zhì)酮孵育后，細胞內(nèi)總鐵含量呈上升趨勢（P 0.05）。干擾KLF4后，皮質(zhì)酮對HT-22細胞內(nèi)鐵含量影響無明顯影響（P0.05）。 結(jié)論 1.應激組大鼠皮質(zhì)酮水平明顯升高，說明大鼠心理應激模型復制成功。應激組大鼠海馬、皮層、紋狀體內(nèi)出現(xiàn)明顯的鐵蓄積并伴有血紅素轉(zhuǎn)運蛋白HCP1的高表達，提示應激大鼠腦鐵蓄積可能與HCP1有關； 2. HT-22細胞內(nèi)總鐵含量隨著血紅素鐵濃度及孵育時間的延長呈增加趨勢，結(jié)合熒光顯微鏡圖片顯示，可以確定HT-22細胞HCP1有攝取血紅素鐵功能，提示細胞可以通過攝取血紅素鐵而增加細胞內(nèi)鐵含量。 3.動物實驗發(fā)現(xiàn)應激組大鼠海馬、皮層內(nèi)HCP1的轉(zhuǎn)錄因子KLF4表達明顯升高，其他轉(zhuǎn)錄因子無明顯變化。細胞實驗證實皮質(zhì)酮對HT-22細胞HCP1及KLF4的表達有上調(diào)作用，且皮質(zhì)酮可以增加HT-22細胞內(nèi)鐵含量。干擾KLF4后，皮質(zhì)酮對HT-22細胞HCP1的上調(diào)作用被取消，細胞內(nèi)鐵的含量也無明顯變化，提示皮質(zhì)酮可以通過KLF4影響HT-22細胞HCP1表達及細胞內(nèi)鐵含量。 綜合上述實驗結(jié)果，我們推測大鼠心理應激后部分腦區(qū)鐵蓄積，可能是由于應激時大鼠皮質(zhì)酮分泌的增加上調(diào)了KLF4的表達，，從而HCP1表達升高，使腦內(nèi)血紅素鐵攝入增多，最終導致大鼠部分腦區(qū)鐵蓄積。
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【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R741

【參考文獻】

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本文編號：2490225