發(fā)布時間：2019-05-12 19:41

【摘要】：目的： 探討CD133抗體標(biāo)記的磁性納米粒子(Fe304)介導(dǎo)的熱療對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的作用效果,并初步探討其可能相關(guān)的作用機(jī)制,為膠質(zhì)瘤的臨床治療提供新的思路和方法,使治療效果得到改善。 方法： 1.使用添加神經(jīng)生長因子的無血清培養(yǎng)基在37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)U251膠質(zhì)瘤干細(xì)胞,并進(jìn)行隨機(jī)分組：將GSCs分為非磁場組與磁場組,然后每組再分別分為Control(無添加劑)、Fe304(添加納米粒子25μg/ml)、CD133+Fe3O4(添加抗體標(biāo)記的納米粒子25μg/ml)3組。 2.按照實驗分組分別處理各組細(xì)胞后,進(jìn)行MTT檢測,分別于0h、24h、48h,72h、96h在490mim測定吸光度,記錄并繪制細(xì)胞生長曲線,計算細(xì)胞抑制率,并根據(jù)最大抑制率確定最佳作用時間。 3.根據(jù)MTT結(jié)果確定的最佳處理時間點對分組處理后的各組細(xì)胞行臺盼藍(lán)染色,進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),并根據(jù)公式：細(xì)胞死亡率染藍(lán)細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù),計算各組細(xì)胞的死亡率。 4.為檢測細(xì)胞周期變化及凋亡情況,選取MTT最佳作用時間之前的時間點(抑制效果明顯但細(xì)胞死亡率較低時),分別處理各組細(xì)胞進(jìn)行以下檢測：采用PI染色法流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組中GSCs的細(xì)胞周期變化情況；分組處理后收集各組細(xì)胞,進(jìn)行Tunel染色檢測細(xì)胞凋亡情況。 5.選擇與上述相同時間點分別處理各組細(xì)胞,檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的變化：采用免疫組化方法檢測經(jīng)分組處理后各組細(xì)胞FAS、BCL-2表達(dá)的變化；通過Western Blot檢測經(jīng)分組處理后各組細(xì)胞FAS、BCL-2蛋白水平的變化情況；通過熒光定量PCR檢測經(jīng)分組處理后各組細(xì)胞FAS、BCL-2基因水平的變化情況。 結(jié)果： 1.MTT結(jié)果顯示,與其他各組相比,磁場組中Fe304組與CD133+Fe3O4組的細(xì)胞生長在24h后開始受到抑制,以72h抑制最為明顯且細(xì)胞出現(xiàn)明顯死亡,兩組的抑制率分別達(dá)16%和36%,以CD133+Fe3O4組更為明顯(P0.05)。 2.根據(jù)MTT結(jié)果選擇最佳作用時間點72h對各組細(xì)胞進(jìn)行臺盼藍(lán)拒染實驗,結(jié)果顯示,磁場組細(xì)胞死亡率明顯高于非磁場組(P0.01),且磁場組中Fe304組與CD133+Fe3O4組細(xì)胞死亡率分別達(dá)68%和81%,以CD133+Fe3O4組最為明顯(P0.05)。 3.分組處理各組細(xì)胞后48h進(jìn)行PI染色流式細(xì)胞術(shù),結(jié)果顯示,磁場組中Fe304組與CD133+Fe3O4組的細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯凋亡峰,分別為4.42%與7.67%；Tunel染色結(jié)果顯示磁場組中Fe304組與CD133+Fe3O4組內(nèi)可見大量呈棕色的凋亡細(xì)胞核,而其他組內(nèi)棕色反應(yīng)不明顯。 4.各組細(xì)胞經(jīng)分組處理后48h行免疫組化檢測,結(jié)果顯示,非磁場組中各組FAS和BCL-2的表達(dá)與對照組相比變化不明顯,而磁場組中Fe304組與CD133+Fe3O4組的FAS表達(dá)較對照組增多,BCL-2表達(dá)較對照組降低。 5. Western blot結(jié)果顯示,細(xì)胞經(jīng)處理48h后,磁場組中Fe304組與CD133+Fe3O4組FAS蛋白的相對表達(dá)量較其他組明顯增多,分別達(dá)β-actin的5.19倍和5.97倍；BCL-2蛋白的相對表達(dá)量較對其他組明顯降低,分別為β-actin的0.38倍和0.20倍,均以CD133+Fe3O4組變化最明顯(P0.05)。 6.熒光定量PCR結(jié)果顯示,細(xì)胞經(jīng)處理48h后,磁場組中Fe304組與CD133+Fe3O4組FAS基因的相對表達(dá)量較其他組明顯增多,分別達(dá)對照組的2.87倍和3.34倍；BCL-2基因的相對表達(dá)量較對其他組明顯降低,分別為對照組的0.55倍和0.23倍,均以CD133+Fe3O4組變化最為明顯(P0.05)。 結(jié)論：CD133是腦腫瘤干細(xì)胞的重要標(biāo)記物,通過CD133抗體標(biāo)記磁性納米粒子能有效實現(xiàn)靶向治療。磁性熱療能有效抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的生長,其作用機(jī)制可能涉及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。FAS和BCL-2均參與了熱療過程中的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)。使用CD133抗體標(biāo)記的磁性納米粒子介導(dǎo)熱療,能明顯抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的生長,且作用較單純磁性熱療更為顯著。
[Abstract]:Purpose: To investigate the effect of magnetic nanoparticles (Fe304) mediated by CD133 antibody on glioma stem cells, and to explore the possible mechanisms of action, to provide a new way of thinking and method for the clinical treatment of glioma, and to change the therapeutic effect. Good. Methods:1. U251 glioma stem cells were cultured at 37 鈩，

本文編號：2475650