發(fā)布時(shí)間：2019-04-28 11:32

【摘要】：第一部分iTRAQ偶聯(lián)2DLC MS/MS技術(shù)分析脛前肌在失神經(jīng)支配過程中的蛋白表達(dá)差異 目的 通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析脛前肌在失神經(jīng)支配后不同時(shí)間點(diǎn)的蛋白質(zhì)表達(dá)變化，采用生物信息學(xué)分析，篩選出與失神經(jīng)肌萎縮相關(guān)的“關(guān)鍵”蛋白質(zhì)，研究該蛋白的生物學(xué)功能，為揭示失神經(jīng)肌萎縮的分子機(jī)理提供資料，為失神經(jīng)肌萎縮的防治提供科學(xué)依據(jù)。 方法 1.制備大鼠坐骨神經(jīng)離斷模型：SD大鼠24只，隨機(jī)分為4組，每組6只。1組行假手術(shù)，作為對照組；另3組動(dòng)物行左側(cè)坐骨神經(jīng)切斷術(shù)，分為術(shù)后1周組、術(shù)后4周組和術(shù)后8周組； 2.提取肌肉總蛋白，采用Bradford法測定總蛋白濃度，蛋白樣品經(jīng)還原、烷基化、酶解、iTRAQ標(biāo)記和強(qiáng)陽離子交換色譜分離，然后使用納升高效液相系統(tǒng)（Nano UPLC system）串聯(lián)LTQ Orbitrap XL質(zhì)譜儀采集數(shù)據(jù)； 3.通過SEQUEST軟件鑒定并定量多肽和蛋白質(zhì)，獲得差異表達(dá)的蛋白質(zhì)； 4.通過Swiss-Prot/TrEMBL和GO數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行功能分類，并通過生物信息學(xué)方法（GO、KEGG和STRING）分析差異表達(dá)的蛋白，篩選出與失神經(jīng)肌萎縮相關(guān)的“關(guān)鍵”蛋白質(zhì)； 5.通過Western blot方法對部分差異表達(dá)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證； 6.體外誘導(dǎo)肌管萎縮模型，探討關(guān)鍵蛋白的生物學(xué)功能。 結(jié)果 1. iTRAQ偶聯(lián)2DLC MS/MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)260個(gè)蛋白質(zhì)在大鼠脛前肌萎縮過程中的表達(dá)發(fā)生變化，這些蛋白質(zhì)主要涉及代謝酶、結(jié)構(gòu)蛋白、信號(hào)分子、伴侶蛋白、能量代謝相關(guān)蛋白、核蛋白等，代謝酶是最大的一類； 2.這些差異表達(dá)的蛋白主要包括4種變化趨勢：⑴54個(gè)蛋白在失神經(jīng)支配后脛前肌萎縮過程中表達(dá)逐漸下降;⑵17個(gè)蛋白在失神經(jīng)支配后1周或4周上調(diào)，隨后又表達(dá)下降；這兩種變化趨勢的蛋白主要涉及能量代謝相關(guān)蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、核蛋白等。⑶101個(gè)蛋白在失神經(jīng)支配后脛前肌萎縮過程中表達(dá)逐漸上升;⑷88個(gè)蛋白在失神經(jīng)支配后1周或4周下調(diào)，隨后又表達(dá)上升；這兩種變化趨勢的蛋白主要涉及伴侶分子、代謝酶、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、信號(hào)分子以及泛素化蛋白酶體通路相關(guān)蛋白等； 3. GO分析顯示這些差異表達(dá)的蛋白涉及的生物學(xué)過程主要包括glycolysis（糖酵解）、tricarboxylic acid cycle（三羧酸循環(huán)）和cellular respiration（細(xì)胞呼吸）等； 4. KEGG分析顯示這些差異表達(dá)的蛋白涉及的信號(hào)通路主要包括Citratecycle （檸檬酸循環(huán)）、Glycolysis/Gluconeogenesis（糖酵解/糖異生）和Neurotrophinsignaling pathway（神經(jīng)營養(yǎng)信號(hào)通路）等； 5. STRING相互作用分析結(jié)果提示腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）（在本研究中沒有被蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測到）可能在失神經(jīng)肌萎縮過程中表達(dá)上調(diào)并發(fā)揮重要作用； 6.通過Western blot分別對2個(gè)高表達(dá)蛋白（CRYAB和PEBP1）和2個(gè)低表達(dá)蛋白（KCRS和PYGM）進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測一致；同時(shí)對預(yù)測的蛋白TRAF6也進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)實(shí)際表達(dá)變化與預(yù)測結(jié)果一致； 7. TRAF6在地塞米松誘導(dǎo)的C2C12肌管萎縮過程中表達(dá)上調(diào)，抑制TRAF6的表達(dá)可以減輕地塞米松誘導(dǎo)的C2C12肌管萎縮。 結(jié)論 1. iTRAQ偶聯(lián)2D LC-MS/MS的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)260個(gè)蛋白質(zhì)在大鼠脛前肌萎縮過程中的表達(dá)發(fā)生變化，這些蛋白質(zhì)主要涉及代謝酶、結(jié)構(gòu)蛋白、信號(hào)分子、伴侶蛋白等； 2.生物信息學(xué)分析提示能量代謝紊亂在失神經(jīng)肌萎縮過程中可能發(fā)揮重要作用； 3. TRAF6在失神經(jīng)肌萎縮過程中表達(dá)上調(diào)，體外抑制TRAF6的表達(dá)可以減輕地塞米松誘導(dǎo)的C2C12肌管萎縮。 第二部分TRAF6在失神經(jīng)肌萎縮中的作用及機(jī)制研究 目的 探討TRAF6在失神經(jīng)肌萎縮過程中的作用及調(diào)控機(jī)制。 （一）抑制TRAF6可延緩失神經(jīng)肌萎縮 方法 1.制備坐骨神經(jīng)離斷模型：SD大鼠16只，行左側(cè)坐骨神經(jīng)切斷術(shù)，術(shù)后隨機(jī)分為2組（實(shí)驗(yàn)組和對照組），手術(shù)當(dāng)天實(shí)驗(yàn)組就給予脛前肌多點(diǎn)注射TRAF6siRNA,對照組給予脛前肌多點(diǎn)注射scramble RNA，以后每隔兩天注射一次，共注射5次，第14天取脛前肌； 2.通過稱重法分析脛前肌的濕重比，通過Masson三色染色法分析脛前肌肌纖維截面積； 3.通過Western blot方法檢測TRAF6在實(shí)驗(yàn)組和對照組脛前肌中的表達(dá)變化，同時(shí)檢測其下游靶基因MuRF1和MAFBx在實(shí)驗(yàn)組和對照組脛前肌中的表達(dá)變化。 結(jié)果 1.在失神經(jīng)支配脛前肌中注射TRAF6siRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRAF6siRNA注射組的脛前肌濕重比以及肌纖維截面積均明顯大于對照組（P0.05）； 2. TRAF6siRNA注射組脛前肌中的TRAF6表達(dá)受到明顯抑制（P0.05），TRAF6下游靶基因MuRF1和MAFBx也受到顯著抑制（P0.05）。 （二）miR-351與TRAF63’UTR相互作用 方法 1.通過realtime RT-PCR檢測miR-351在失神經(jīng)肌萎縮過程中的表達(dá)變化；分析其與TRAF6表達(dá)的相關(guān)性； 2.構(gòu)建含有靶基因TRAF63'-UTR野生型及TRAF63'-UTR突變型（seedregion mutant）的雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)； 3.將TRAF63'-UTR野生型或TRAF63'-UTR突變型與miR-351mimic或miRNA mimic Negative Control共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，檢測熒光素酶活性。 結(jié)果 1. miR-351在失神經(jīng)肌萎縮過程中的表達(dá)逐漸下降，miR-351和TRAF6在失神經(jīng)肌萎縮過程中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)； 2.成功構(gòu)建含TRAF63'-UTR野生型及TRAF63'-UTR突變型的雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)； 3.熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)，miR-351可以顯著抑制含有野生型TRAF63'-UTR質(zhì)粒的熒光素酶活性，對含有突變型TRAF63'-UTR質(zhì)粒的熒光素酶活性沒有影響。 （三）miR-351可延緩失神經(jīng)肌萎縮 方法 1.制備坐骨神經(jīng)離斷模型：SD大鼠16只，行左側(cè)坐骨神經(jīng)切斷術(shù)，術(shù)后隨機(jī)分為2組（實(shí)驗(yàn)組和對照組），手術(shù)當(dāng)天實(shí)驗(yàn)組就給予脛前肌多點(diǎn)注射miR-351agamir,對照組給予脛前肌多點(diǎn)注射miRNA agomir Negative Control，以后每隔兩天注射一次，共注射5次，第14天取脛前肌； 2.通過稱重法分析對脛前肌的濕重比，通過Masson三色染色法分析脛前肌肌纖維截面積； 3.通過realtime RT-PCR檢測miR-351在實(shí)驗(yàn)組和對照組脛前肌中的表達(dá)變化，通過Western blot方法檢測TRAF6及其下游靶基因MuRF1和MAFBx在實(shí)驗(yàn)組和對照組脛前肌中的表達(dá)變化。 結(jié)果 1.在失神經(jīng)支配脛前肌中注射miR-351agamir，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組脛前肌濕重比以及肌纖維截面積均明顯大于對照組（P0.05）； 2. miR-351agamir注射組脛前肌中的TRAF6表達(dá)受到明顯抑制（P0.05），TRAF6下游靶基因MuRF1和MAFBx也受到明顯抑制（P0.05）。 結(jié)論 1.抑制TRAF6的表達(dá)可延緩失神經(jīng)支配骨骼肌萎縮； 2. miR-351和TRAF6在失神經(jīng)肌萎縮過程中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，miR-351與TRAF63’UTR之間存在相互作用； 3. miR-351可通過靶向抑制TRAF6的而延緩失神經(jīng)支配骨骼肌萎縮。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R746.4

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 潘建偉;人巨細(xì)胞病毒潛伏感染下細(xì)胞的自噬現(xiàn)象[D];浙江大學(xué);2014年

2 尤亞南;豬帶絳蟲烯醇化酶基因的克隆、原核表達(dá)及功能研究[D];新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

，

本文編號(hào)：2467592