【摘要】：研究目的:1.建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型(in vivo),觀察12/15-脂氧酶產(chǎn)物12s-羥基二十四碳四烯酸(12s-hydroxyeicosatetraenoic,12s-HETE)對腦組織PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptorsg)表達(dá)及活性的影響,以及對炎癥的抑制作用,并初步探討12/15-脂氧酶(12/15-lipoxygenase,12/15-LOX)途徑在缺血腦組織中調(diào)控PPARγ的意義。2.建立體外原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元氧糖剝奪(Oxygen-Glucose Deprivation,OGD)損傷模型(in vitro),觀察體外原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元在OGD損傷后,細(xì)胞內(nèi)12/15-脂氧酶、PPARγ的蛋白表達(dá)及活性變化;并多方法抑制12/15-脂氧酶或外源性給予12/15-脂氧酶產(chǎn)物(12s-HETE),觀察對OGD神經(jīng)元中PPARγ及其活性(靶基因表達(dá)、DNA結(jié)合活性等)的影響,進(jìn)而確定OGD神經(jīng)元中12/15-脂氧酶途徑對PPARγ的調(diào)控作用。3.建立體外原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元過氧化氫損傷模型,觀察過氧化氫損傷神經(jīng)元內(nèi)ERK1/2表達(dá)及激活、PPARγ表達(dá)、磷酸化修飾及活性變化;抑制ERK1/2激活對PPARγ的影響;以確定過氧化氫損傷神經(jīng)元中ERK1/2途徑對PPARγ的調(diào)節(jié)作用。研究方法:1.將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注模型組、12s-HETE干預(yù)組。采用神經(jīng)功能缺損評分、TTC染色評估12s-HETE對腦缺血再灌注(缺血60min/再灌注24小時)大鼠的損傷程度、梗死體積的影響;免疫組化、western blot技術(shù)檢測PPARγ、i NOS、活化Caspase3等的表達(dá)和活性。2.自孕18-21d SD雌性大鼠,進(jìn)行胎鼠大腦皮層神經(jīng)元原代體外培養(yǎng)。至7d于倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài),以免疫熒光染色法對神經(jīng)元進(jìn)行純度鑒定(MAP2表達(dá))。建立氧糖剝奪再灌注損傷模型,倒置相差顯微鏡觀察不同OGD損傷組細(xì)胞形態(tài)變化、MTT法測定細(xì)胞相對存活率。神經(jīng)元隨機(jī)分組為對照組和OGD損傷60min組、90min組和120min組(再灌注時間均為24小時)。分別提取總蛋白、漿蛋白和核蛋白,利用western blot、免疫熒光技術(shù)檢測各組神經(jīng)元中12/15-脂氧酶和PPARγ各成分蛋白表達(dá)的改變。依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取90min組神經(jīng)元作為OGD損傷組,同時應(yīng)用12/15-脂氧酶抑制劑或反義寡聚核苷酸抑制、給予12/15-脂氧酶產(chǎn)物12s-HETE等多方法干預(yù),對細(xì)胞中12/15-脂氧酶及PPARγ總蛋白、胞漿蛋白、胞核蛋白水平進(jìn)行檢測,并進(jìn)行PPARγ的亞細(xì)胞表達(dá)定位;RT-PCR法檢測PPARγ靶基因(脂蛋白脂酶和乙酰輔酶A氧化酶)m RNA表達(dá);構(gòu)建p GL3-PPRE質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染體外正常培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元細(xì)胞,熒光素酶含量檢測12s-HETE對PPARg-DNA結(jié)合活性的影響。3.原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元,隨機(jī)分組為對照組和過氧化氫損傷組,MTT法觀察神經(jīng)元損傷以確定過氧化氫作用濃度。進(jìn)行ERK1/2、phospho-ERK1/2、PPARγ和phospho-PPARγ蛋白水平表達(dá)的時程研究,同時對PPARγ的核移位和亞細(xì)胞定位進(jìn)行檢測;應(yīng)用多種ERK1/2激活抑制劑,檢測對過氧化氫損傷神經(jīng)元內(nèi)PPARγ表達(dá)和活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.與假手術(shù)組相比較,缺血再灌注損傷組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著增加,平均腦梗死體積為30.24%;腦組織內(nèi)PPARγ總蛋白表達(dá)水平明顯增高,胞漿PPARγ蛋白顯著下降、胞核PPARγ蛋白顯著增加;i NOS(NOS2)表達(dá)水平顯著增高,活化caspase3表達(dá)水平顯著增高。與缺血再灌注組相比較,12s-HETE干預(yù)使大鼠神經(jīng)功能缺損評分降低,腦梗死體積明顯縮小;PPARγ總蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步增高,胞漿PPARγ蛋白進(jìn)一步下降、胞核PPARγ蛋白進(jìn)一步增加;同時使i NOS表達(dá)水平顯著下降,活化caspase3表達(dá)水平顯著下降。2.體外原代培養(yǎng)7d的大鼠皮層神經(jīng)元,形態(tài)飽滿,突起豐富,相互交織成網(wǎng)絡(luò),神經(jīng)元MAP2陽性率95%,可視為比較純的神經(jīng)元培養(yǎng)。體外原代培養(yǎng)7d大鼠皮層神經(jīng)元,OGD損傷60min、90min和120min(再灌注24小時),光鏡下形態(tài)學(xué)均出現(xiàn)損傷性改變;MTT法測定神經(jīng)元細(xì)胞相對存活率降低,分別為61.34±3.14%、43.84±2.07%、15.18±2.32%。Western blot和免疫熒光檢測顯示:與正常對照組神經(jīng)元相比較,OGD損傷組神經(jīng)元PPARγ總蛋白表達(dá)顯著增加,胞漿PPARγ顯著下降、胞核PPARγ顯著增加;12/15-LOX蛋白表達(dá)顯著增加。與OGD損傷組神經(jīng)元相比較,12/15-LOX抑制劑Baicalein(5μM、10μM)或12/15-LOX反義寡聚核苷酸處理組神經(jīng)元,12/15-LOX和PPARγ蛋白水平均有顯著下降,胞漿PPARγ輕度或顯著增加、胞核PPARγ顯著下降。RT-PCR法檢測:與OGD損傷組相比,12s-HETE處理使神經(jīng)元內(nèi)PPARγ靶基因脂蛋白脂酶和乙酰輔酶A氧化酶m RNA水平顯著增加。p GL3-PPRE質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞,12s-HETE處理使熒光素酶活性明顯增加。3.體外原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元,進(jìn)行過氧化氫(50mM、200mM、500mM)處理。光鏡下觀察:過氧化氫50mM處理組神經(jīng)元損傷較輕,過氧化氫500mM處理組神經(jīng)元損傷最為顯著,但神經(jīng)元死亡過多;MTT法計(jì)算神經(jīng)元相對存活率分別為過氧化氫50mM組75.25±3.31%、200mM組53.84±2.42%、500mM組21.18±1.33%,選用過氧化氫200mM作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)處理濃度。Western blot檢測顯示:過氧化氫處理0~24h神經(jīng)元ERK1/2總蛋白無顯著變化,phospho-ERK1/2于過氧化氫處理約0.5h~3h內(nèi)顯著上調(diào),之后迅速下降至基礎(chǔ)表達(dá)水平;PPARγ總蛋白在過氧化氫處理0~3h神經(jīng)元中表達(dá)無顯著變化,6h~24h顯著下降;phospho-PPARγ于過氧化氫處理約0.5h~3h時顯著上調(diào),之后開始下降,但6h組仍高于0h組,12h~24h蛋白表達(dá)水平顯著降低。核移位檢測顯示:與正常對照組神經(jīng)元(0h組)相比較,過氧化氫損傷0.5h、3h組神經(jīng)元PPARγ胞漿蛋白水平均顯著上升,同時胞核蛋白水平均顯著下降。與過氧化氫處理組相比較,ERK1/2抑制劑U0126或PD98059處理組神經(jīng)元phospho-ERK1/2和phospho-PPARγ蛋白水平均顯著下降,神經(jīng)元PPARγ胞漿蛋白水平減少、胞核蛋白水平顯著增加。研究結(jié)論:1.12/15-LOX產(chǎn)物12s-HETE促進(jìn)缺血再灌注損傷大鼠腦組織PPAR?的表達(dá)和核移位,同時抑制缺血再灌注損傷腦組織中炎性介質(zhì)的產(chǎn)生和促凋亡因子表達(dá),具有腦保護(hù)作用。初步推測,12s-HETE的這種腦保護(hù)作用可能是通過對PPAR?的激活實(shí)現(xiàn)的。進(jìn)一步推測在缺血再灌注損傷腦組織中,可能存在12/15-LOX途徑對PPARγ的激活調(diào)控作用。2.體外原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元OGD損傷誘導(dǎo)神經(jīng)元12/15-LOX和PPARγ表達(dá)上調(diào)及活性增加;12/15-LOX選擇性抑制劑和反義寡聚核苷酸可顯著抑制OGD誘導(dǎo)的12/15-LOX和PPARγ改變;12/15-LOX產(chǎn)物12s-HETE可顯著上調(diào)OGD誘導(dǎo)的12/15-LOX和PPARγ改變,同時增加PPARγ轉(zhuǎn)錄活性。推測在體外原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元OGD損傷中,存在12/15-LOX途徑對PPARγ的激活調(diào)控作用。3.體外原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元,過氧化氫引起PPARγ磷酸化修飾和PPARγ表達(dá)下調(diào):前者發(fā)生在早期(3h),過氧化氫通過激活ERK1/2,介導(dǎo)PPARγ磷酸化并引起PPARγ活性下降(PPARγ核移位抑制);后者出現(xiàn)在后期(6h),表現(xiàn)為PPARγ蛋白水平的顯著下調(diào)。因此,推測過氧化氫通過增加PPARγ磷酸化和抑制蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)對PPARγ的負(fù)性調(diào)節(jié)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R743
【共引文獻(xiàn)】
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本文編號：
2463240
