【摘要】：目的：腦血管病是導(dǎo)致我國(guó)成人殘疾和死亡的第一原因，其中以缺血性腦血管病最為常見(jiàn)。治療腦缺血最有效的辦法是再灌，但再灌本身又會(huì)導(dǎo)致組織損傷，其中炎癥扮演了主要角色。NALP3炎癥復(fù)合體是一種多蛋白復(fù)合結(jié)構(gòu)。它由NALP3（NACHT domain-, leucine-rich repeat-, andpyrin domain (PYD)-containing protein3）、 ASC （apoptosis-associatedspeck-like protein containing a caspase recruitment domain）和caspase-1組成，其功能主要為調(diào)節(jié)炎癥應(yīng)答。 大黃酚是大黃屬植物的提取物，擁有多種藥理作用，其中包含抗炎特性，但其抗炎機(jī)制仍有待闡明。本實(shí)驗(yàn)就大黃酚對(duì)腦缺血再灌的作用，及其潛在機(jī)制進(jìn)行研究。利用雄性CD1小鼠暫時(shí)性大腦中動(dòng)脈閉塞（transientmiddle cerebral artery occlusion, tMCAO）所致腦缺血再灌的模型，觀察腦缺血再灌后大腦皮層NALP3炎癥復(fù)合體的動(dòng)態(tài)表達(dá)，并研究大黃酚在腦缺血再灌急性期的神經(jīng)保護(hù)作用及其對(duì)NALP3炎癥復(fù)合體表達(dá)的影響。 方法：雄性CD1小鼠（25-30g），應(yīng)用改良Longa線(xiàn)栓法建立大鼠右側(cè)tMCAO模型。實(shí)驗(yàn)分為兩部分。 實(shí)驗(yàn)一，動(dòng)態(tài)觀察腦缺血再灌后不同時(shí)間點(diǎn)NALP3炎癥復(fù)合體的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為Sham組（Sham+生理鹽水）、缺血再灌后3h、6h、12h、24h、48h、72h六個(gè)時(shí)間點(diǎn)組（tMCAO+生理鹽水）。 實(shí)驗(yàn)二，探索大黃酚在腦缺血再灌早期的神經(jīng)保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為Sham組（Sham+生理鹽水）、tMCAO組（tMCAO+生理鹽水）、Vehicle組（tMCAO+1%DMSO+1%Tween-80）、大黃酚大劑量組（tMCAO+chrysophnol10mg/kg, CHR-H）、大黃酚中劑量組（tMCAO+chysophnol1mg/kg, CHR-M）、大黃酚小劑量組（tMCAO+chysophnol0.1mg/kg, CHR-L）。 藥物干預(yù)組動(dòng)物于梗死前30分鐘腹腔注射大黃酚。Sham組和tMCAO組用同樣方法給予等量生理鹽水，Vehicle組給予等量溶劑（1%DMSO+1%Tween-80）。術(shù)后24h對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。評(píng)分完畢后將動(dòng)物斷頭處死，用干濕重法測(cè)定腦組織含水量，用2%的2,3,5-三苯基四唑氮紅（triphenyltetrazolium chloride, TTC）染色法測(cè)定腦梗死體積，用伊文斯蘭染色法測(cè)定血腦屏障通透性，用免疫組化、western blotting、qRT-PCR和激光共聚焦技術(shù)測(cè)定NALP3炎癥復(fù)合體和IL-1β的表達(dá)水平。 結(jié)果： 1NALP3, ASC, caspase-1及IL-1β存在于神經(jīng)元中 用激光共聚焦顯微鏡對(duì)NALP3炎癥復(fù)合體及IL-1β在腦皮質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行細(xì)胞定位。在tMCAO組中，可在缺血半暗帶明顯觀察到神經(jīng)元核固縮、染色質(zhì)邊集及少量的中性粒細(xì)胞。在正常腦組織（Sham組）中，caspase-1及NALP3主要表達(dá)于細(xì)胞核，IL-1β主要表達(dá)于胞漿。ASC在胞核胞漿中均有表達(dá)；缺血再灌后，NALP3及caspase-1的表達(dá)位置發(fā)生變化，主要表達(dá)于胞漿，而ASC與IL-1β的表達(dá)位置不變（Fig.3）。 2NALP3, ASC, caspase-1及IL-1β在腦缺血再灌后表達(dá)上調(diào) 用免疫組化，qRT-PCR及western blotting檢測(cè)NALP3,ASC, caspase-1及IL-1β的表達(dá)水平。結(jié)果顯示NALP3、active caspase-1在腦缺血再灌后12h表達(dá)水平開(kāi)始升高，并于24h達(dá)到高峰（Fig4a,4b,4d,4e,4f）。active IL-1β在腦缺血再灌后6小時(shí)表達(dá)水平開(kāi)始升高，同樣于24h達(dá)到高峰。ASC表達(dá)水平直至腦缺血再灌后72h表達(dá)水平才開(kāi)始升高（Fig4c,4d,4e,4f）。因此，我們選取tMCAO術(shù)后24h來(lái)觀察大黃酚的干預(yù)作用，以期證實(shí)大黃酚對(duì)急性腦缺血再灌的保護(hù)作用。 3大黃酚降低行為學(xué)評(píng)分 tMCAO術(shù)后24h，采用6分法對(duì)小鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分（Fig.5a）。Sham組評(píng)分為0。tMCAO組、Vehicle組、藥物干預(yù)組均出現(xiàn)不同程度的左側(cè)肢體偏癱。CHR-H組和CHR-M組的神經(jīng)功能評(píng)分明顯低于tMCAO組及Vehicle組（P 0.05）。CHR-L組與tMCAO組及Vehicle組相比，神經(jīng)功能評(píng)分無(wú)明顯差異（P0.05）。 4大黃酚降低腦梗死體積 Sham組無(wú)梗死灶。與tMCAO組及Vehicle組相比，CHR-H組及CHR-M組梗死體積明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（CHR-H組vs. tMCAO組和Vehicle組：29.80%±1.15%vs.49.87%±1.99%和51.31%±1.57%, P 0.05；CHR-M組vs. tMCAO組和Vehicle組：41.86%±0.98%vs.49.87%±1.99%和51.31%±1.57%, P 0.05）。CHR-L組與tMCAO組及Vehicle組相比，梗死體積無(wú)明顯減�。≒0.05）（Fig.5b,5c）。 5大黃酚降低腦水腫 正常腦組織含水量未見(jiàn)明顯變化。tMCAO術(shù)后24h，tMCAO組與Vehicle組病變側(cè)腦組織含水量明顯增加。CHR-H組及CHR-M組病變側(cè)腦組織含水量較tMCAO組及Vehicle組顯著減少（CHR-H組vs. tMCAO組和Vehicle組：80.60%±0.58%vs.83.75%±0.48%和83.72%±0.35%, P 0.05；CHR-M組vs. tMCAO組和Vehicle組：82.15%±0.68%vs.83.75%±0.48%和83.72%±0.35%, P 0.05）。CHR-L組與tMCAO組及Vehicle組相比，病變側(cè)腦組織含水量未見(jiàn)明顯減輕（P0.05）（Fig.5d）。 6血腦屏障通透性改善 tMCAO術(shù)后24h，CHR-H組及CHR-M組病變側(cè)腦組織伊文斯蘭含量均明顯低于tMCAO組及Vehicle組（P 0.05）。CHR-L組與tMCAO組及Vehicle組相比，伊文斯蘭含量未見(jiàn)明顯減少（P0.05）（Fig.5e,5f）。 7大黃酚抑制NALP3, ASC, caspase-1及IL-1β的表達(dá) tMCAO術(shù)后24h，NALP3，ASC，caspase-1及IL-1β免疫組化結(jié)果顯示（Fig.6）：NALP3, caspase-1及IL-1β在正常腦皮質(zhì)（Sham組）中表達(dá)量很少。與Sham組相比，tMCAO組NALP3, caspase-1及IL-1β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加（P 0.05）。在Vehicle組中觀察到同樣的結(jié)果，，且與tMCAO組無(wú)明顯差異（P0.05）。在CHR-H組及CHR-M組中，NALP3,caspase-1及IL-1β陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)較tMCAO組及Vehicle組明顯減少（P 0.05）（Fig.7e）。之后我們利用western blotting檢測(cè)NALP3, ASC（Fig.7a）,caspase-1（Fig.7b）及IL-1β（Fig.7c）蛋白的表達(dá)水平。與Sham組相比，tMCAO組及Vehicle組NALP3, caspase-1及IL-1β的表達(dá)顯著上升。大、中劑量的大黃酚干預(yù)可明顯降低NALP3, caspase-1及IL-1β的表達(dá)量（P 0.05）（Fig.7d）。與免疫組化、western blotting結(jié)果一致，tMCAO組及Vehicle組NALP3, caspase-1及IL-1βmRNA的表達(dá)較Sham組明顯增加（P 0.05）。與tMCAO組及Vehicle組相比，CHR-H組及CHR-M組NALP3, caspase-1及IL-1β的表達(dá)量明顯減少（P0.05）（Fig.7f）。 結(jié)論：腦缺血再灌后腦組織中NALP3炎癥復(fù)合體及IL-1β的表達(dá)水平顯著升高。大黃酚可以降低行為學(xué)評(píng)分，減少腦梗死體積，減輕腦水腫，改善血腦屏障通透性，對(duì)局灶性腦缺血具有神經(jīng)保護(hù)作用。其保護(hù)作用可能與抑制NALP3炎癥復(fù)合體的表達(dá)，下調(diào)IL-1β的表達(dá)有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R743.3

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本文編號(hào)：2459359