發(fā)布時間：2019-04-09 12:35

【摘要】：肌萎縮側(cè)索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,臨床常表現(xiàn)為上、下運動神經(jīng)元均受累的混合性癱瘓,該病呈進行性加重,最終導(dǎo)致死亡。本病的病因及發(fā)病機制尚不清楚,可能與遺傳易感性、興奮性毒性、氧化應(yīng)激、營養(yǎng)代謝等多種因素相關(guān)。病理性蛋白聚合物,即泛素化包涵體,是ALS的主要特征,并且無論在家族性還是散發(fā)性ALS患者中都可以發(fā)現(xiàn)。TDP-25是在ALS患者中發(fā)現(xiàn)的TDP-43的C末端片段,分子量為25k Da。研究發(fā)現(xiàn),TDP-25對神經(jīng)元具有毒性作用,它可促進TDP-43包涵體的形成,對細胞造成損傷,導(dǎo)致神經(jīng)元發(fā)生變性,但其具體致病機制尚不清楚。許多目前對神經(jīng)元興奮性的了解來源于對ALS相關(guān)m SOD1突變基因的研究,以往的研究發(fā)現(xiàn),無論是散發(fā)性還是家族性ALS患者均表現(xiàn)出皮層的高興奮性,因此我們推測兩者存在相同的致病機制。細胞在代謝過程當(dāng)中會產(chǎn)生一系列的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),正常情況下ROS的產(chǎn)生和清除之間處于一種平衡的狀態(tài)而使細胞免受自由基的損傷。研究表明,突變TDP-43誘導(dǎo)了氧化應(yīng)激,導(dǎo)致了ROS產(chǎn)生與清除之間的失衡及線粒體功能損傷,不同的氧自由基成分可直接增強細胞電壓門控鈉通道的活性,通過改變鈉通道的特性提高細胞興奮性。本實驗室以前也已證明,在TDP-43細胞模型中,氧化應(yīng)激及線粒體功能損傷同時存在,這種損傷可被一種安全有效的抗氧化劑雙甲氧姜黃素改善。電壓門控鈉通道(Voltage-gated sodium channels,VGSCs或Navchannels)在動作電位的起始和傳播中起到關(guān)鍵作用,這是形成細胞興奮性的基礎(chǔ)。因此本實驗的首要目的是研究TDP-25對運動神經(jīng)元細胞系電壓門控鈉通道的影響來評估其對神經(jīng)元興奮性的改變。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)是一種臨床上呼吸道感染療效較好的祛痰劑。其分子中的巰基(-SH)可作為H+供體直接發(fā)揮抗氧化作用,另外它還可以合成具有生物活性的谷胱甘肽,間接發(fā)揮抗氧化作用。另有研究表明,其具有較強的干擾自由基生成及清除已生成的活性氧自由基、抗細胞凋亡、調(diào)節(jié)基因表達及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等作用。因此,本實驗的第二目的是探討突變組加入不同濃度NAC后,鈉通道電生理特性是否發(fā)生改變。通過實驗結(jié)果分析ALS可能的發(fā)病機制。目的:檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-25基因的運動神經(jīng)元樣細胞中電壓門控鈉通道的性質(zhì)是否發(fā)生改變,以探討TDP-25使運動神經(jīng)元發(fā)生變性的可能機制;并進一步探討N-乙酰半胱氨酸對電壓門控鈉離子通道功能的調(diào)節(jié)作用。方法:應(yīng)用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-25基因及空質(zhì)粒(Empty vector)的兩種細胞,該細胞系由本院神經(jīng)病學(xué)實驗室構(gòu)建,依照NSC34細胞株的培養(yǎng)方法進行培養(yǎng),將篩選所得細胞系進行培養(yǎng)、傳代、種小片,將種好細胞的培養(yǎng)皿放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),24小時后取出,在全細胞膜片鉗技術(shù)電壓鉗模式下,應(yīng)用電壓依賴性激活、快速失活及恢復(fù)、進入緩慢失活、緩慢失活的電壓依賴性5種不同的刺激程序記錄上述兩種細胞鈉電流并分析其性質(zhì)改變;分別用20μM、50μM、80μM三種不同終濃度的NAC處理TDP-25細胞(NAC20組、NAC50組、NAC80組),24小時后取出,給予上述相同的刺激程序,再次記錄三種不同濃度NAC的電壓門控鈉通道電流。結(jié)果:1電壓依賴性激活:五組細胞的鈉通道均存在電壓依賴性,都是在刺激電壓為-35m V時被激活,開始出現(xiàn)內(nèi)向鈉電流,之后隨著刺激電壓的增大,鈉電流逐漸增大。Empty組(n=12)在-5m V時電流達到最大值,為-87.335±42.934p A/p F,TDP-25組(n=13)在刺激電壓為-15m V時電流達峰值,為-118.563±38.207p A/p F。余三種細胞均在刺激電壓為-10m V時電流達峰值,NAC20組(n=9)、NAC50組(n=13)和NAC80組(n=11)的電流峰值分別為-123.255±35.632p A/p F,-98.619±34.391p A/p F,-104.608±39.110p A/p F。五種細胞在電流達到峰值以后均逐漸減小。TDP-25組的半數(shù)激活電壓V1/2(-30.717±1.494)較Empty組(-22.720±1.907)、NAC50組(-21.733±0.818)、NAC20組(-24.776±2.536)及NAC80組(-28.380±2.693)均提前,而Empty組、NAC50組則較低、高濃度加藥組延后。盡管有數(shù)值上的差異,然而五種細胞的半數(shù)激活電壓并沒有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。TDP-25的斜率因子k(1.849±1.294)較Empty組(2.883±1.850,P0.05)減小,較NAC50組(3.667±0.663,P0.01)顯著減小,而和NAC20組(2.416±2.202,P0.05)、NAC80組(2.157±1.154,P0.05)比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。2穩(wěn)態(tài)快速失活:在預(yù)刺激電壓為-100~-80m V時五種細胞的電壓門控鈉通道電流大小比較恒定,隨著刺激電壓的改變,鈉電流不發(fā)生大的改變。在電壓為-80~-10m V之間,隨著刺激電壓的增大,鈉電流逐漸減小直至消失。五種細胞的半數(shù)失活電壓V1/2、斜率因子k均無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。3快速失活后的恢復(fù):TDP-25組的恢復(fù)時間常數(shù)(n=15τ=5.252±1.574)較NAC50組(n=13τ=6.863±1.827,P0.05)減小,較Empty組(n=18τ=7.238±2.104,P0.01)顯著減小。然而,TDP-25組與低(n=12τ=5.567±1.756,P0.05)、高(n=18τ=5.826±2.215,P0.05)濃度NAC加藥組相比無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。4進入緩慢失活:NAC50組細胞進入緩慢失活狀態(tài)后鈉通道的可用部分(n=10 0.355±0.178)明顯小于TDP-25組(n=13 0.576±0.157,P0.05)、Empty組(n=9 0.529±0.187,P0.05)、NAC20組(n=12 0.522±0.200,P0.05)及NAC80組(n=10 0.513±0.159,P0.05)。而后四組細胞進入緩慢失活狀態(tài)的比例相似,無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。5電壓依賴性緩慢失活:NAC50組(n=12)的I/Imax值在條件電壓為-50~-10m V之間明顯小于其他四組細胞(P0.05)。TDP-25組的半數(shù)失活電壓(n=11 V1/2=-16.580±0.658)較Empty組(n=9 V1/2=-24.113±0.668,P0.05)和NAC50組(n=8 V1/2=-40.763±1.081,P0.001)明顯延后,有統(tǒng)計學(xué)意義。NAC80組的斜率因子k(n=10 k=15.466±2.235)較其他四組細胞增大(P0.05)。結(jié)論:1穩(wěn)定表達突變TDP-25的運動神經(jīng)元,電壓門控鈉離子通道快速失活的恢復(fù)快于對照組神經(jīng)元,提示TDP-25可使運動神經(jīng)元快速失活后能夠較快的進入備用狀態(tài),減小動作電位間的絕對不應(yīng)期時間,快速爆發(fā)動作電位,增加運動神經(jīng)元的興奮性。2 50μmol/L的NAC是一種有效的自由基清除劑,可顯著延長TDP-25所致的電壓門控鈉離子通道快速失活后恢復(fù)的時間,同時可以加快運動神經(jīng)元進入緩慢失活,提示適量的清除氧自由基,可有效的改善電壓門控鈉離子通道快速失活和緩慢失活功能,有助于延長絕對不應(yīng)期,減少動作電位的頻率。3有效的(50μmol/LNAC)清除氧自由基,可改善TDP-25所致的運動神經(jīng)元電壓門控鈉離子通道的功能異常,提示氧化應(yīng)激是運動神經(jīng)元變性的重要機制之一。4過少(20μmol/L NAC)或者過多(80μmol/L NAC)的清除氧自由基并不能恢復(fù)TDP-25所致的運動神經(jīng)元電壓門控鈉離子通道的功能異常,提示維持正常細胞功能需要適量的氧自由基。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R744.8

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 申海燕,李濤平;肺泡Ⅱ型細胞鈉通道的生物學(xué)特點及調(diào)節(jié)機制[J];國外醫(yī)學(xué).呼吸系統(tǒng)分冊;2005年07期

2 李勇鋒;劉敏;;鈉通道的分離純化及其結(jié)合活性的研究[J];中國藥理學(xué)通報;2007年11期

3 王洪躍;魏樹源;;昆蟲鈉通道的研究及其應(yīng)用[J];中國醫(yī)學(xué)裝備;2009年03期

4 鐘河江,楊天德;背根神經(jīng)節(jié)鈉通道與疼痛[J];中國臨床康復(fù);2003年04期

5 歐紹武,龜山亞砂子,郝麗英,龜山正樹,李金鳴;克隆的人神經(jīng)母細胞瘤細胞株渶毒素抵抗型鈉通道的功能分析[J];中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志;2005年04期

6 馮桂學(xué);雒飛飛;戴秋云;;鈉通道芋螺毒素研究進展[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2007年06期

7 徐妍;肖玉成;;鈉通道及其相關(guān)疾病綜合征[J];生物學(xué)通報;2006年01期

8 吳躍進;甲氧普胺阻滯心肌鈉通道的計算機模擬研究[J];生物物理學(xué)報;1992年04期

9 齊興柱,袁婺洲,吳秀山;心臟鈉通道疾病[J];生命科學(xué)研究;2004年S1期

10 崔梓豪;李青南;陸幸妍;;上皮鈉通道與疾病和藥物機制的研究進展[J];廣東醫(yī)學(xué);2012年19期

相關(guān)會議論文 前10條

1 曹虹;丁振華;;缺氧對大鼠腦灰質(zhì)神經(jīng)元鈉通道蛋白發(fā)育的影響[A];中國蛋白質(zhì)組學(xué)首屆學(xué)術(shù)大會論文摘要集[C];2003年

2 曹虹;丁振華;;缺氧環(huán)境中δ鴉片受體對鈉通道蛋白的調(diào)節(jié)作用[A];中國蛋白質(zhì)組學(xué)首屆學(xué)術(shù)大會論文摘要集[C];2003年

3 曹虹;丁振華;;大鼠腦神經(jīng)元鈉通道蛋白的發(fā)育研究[A];中國蛋白質(zhì)組學(xué)首屆學(xué)術(shù)大會論文摘要集[C];2003年

4 黃崢嶸;唐其柱;吳鋼;沈滌非;王騰;;纈草單萜氧化物對單個兔心室肌細胞鈉通道的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會心血管病分會第八次全國心血管病學(xué)術(shù)會議匯編[C];2004年

5 劉中華;蔡天夫;李丹;朱奇;劉宇;李嘉妍;吳U，

本文編號：2455188