【摘要】：第一章新生小鼠海馬、嗅球及皮質神經干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定背景:神經干細胞是指一組具有自我更新、自我復制以及定向分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞潛能的細胞群,主要存在于哺乳動物腦組織中的嗅球、海馬齒狀回、大腦皮質、室管膜上區(qū)、脊髓等中樞神經組織中。具有多向分化潛能的神經干細胞可以用于中樞神經系統(tǒng)疾病的治療。目的:建立一套高效完整的神經干細胞分離培養(yǎng)鑒定體系,分別從新生小鼠海馬、嗅球、皮層組織篩選出生物學性狀均一的種子細胞,建立神經干細胞庫,為后續(xù)研究奠定實驗室基礎。方法:分別從新生昆明小鼠分離海馬、嗅球、皮層組織采用機械分離和胰酶消化法提取原代神經干細胞。采用無血清培養(yǎng)技術、機械吹打和酶消化法對提取的原代神經干細胞進行培養(yǎng)及傳代純化神經干細胞。以10%的胎牛血清誘導分化純化的神經干細胞,細胞免疫熒光行CD133、巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ、膠質纖維酸性蛋白染色,鑒定神經干細胞及其分化產物。細胞凍存與復蘇技術建立神經干細胞庫。結果與結論:從新生小鼠海馬、嗅球、皮層可提取出具有自我更新和多向分化能力的神經干細胞,神經干細胞巢蛋白、CD133免疫熒光檢測呈陽性;神經干細胞經胎牛血清誘導后可分化為β-微管蛋白Ⅲ、膠質纖維酸性蛋白陽性細胞。說明本實驗室成功建立了新生鼠海馬、嗅球、皮層神經干細胞體外分離培養(yǎng)鑒定體系。第二章糖氧剝奪對神經干細胞增殖、分化及凋亡的影響背景:缺氧作為神經系統(tǒng)疾病發(fā)展過程中諸多病理因素中最常見的因素之一,對于內源性神經干細胞以及移植后外源性神經干細胞的存活、遷移、分化、凋亡發(fā)揮著諸多調控作用。目的:系統(tǒng)觀察體外培養(yǎng)環(huán)境下,糖氧剝奪對神經干細胞增殖、分化、凋亡的影響。方法:從新生鼠嗅球分離培養(yǎng)出神經干細胞,建立糖氧剝奪模型,將神經干細胞分為常氧組和缺氧組,免疫熒光技術檢測糖氧剝奪后神經干細胞分化能力,MTT法檢測糖氧剝奪24,48 h后恢復正常條件培養(yǎng)對神經干細胞增殖能力的影響,Hochest33258熒光染色檢測糖氧剝奪24,48 h時后神經干細胞凋亡狀況。結果與結論:第4代神經干細胞CD133免疫熒光鑒定結果呈陽性表達,MTT細胞增殖能力檢測結果示:糖氧剝奪組增殖能力明顯低于常氧組(P0.05),糖氧剝奪48 h組增殖能力低于糖氧剝奪24 h組(P0.05)。GFAP、β-TubulinⅢ細胞免疫熒光染色結果示糖氧剝奪48 h時后神經干細胞分化為星型膠質細胞、神經元總數明顯低于常氧組(P0.05)。Hochest33258染色凋亡率檢測結果示糖氧剝奪組細胞凋亡率明顯高于常氧組(P0.01),糖氧剝奪48 h組神經干細胞凋亡率顯著高于糖氧剝奪24 h組(P0.01)。上述結果表明糖氧剝奪對神經干細胞增殖、分化、凋亡造成不利影響,影響程度取決于神經干細胞對于缺氧濃度、缺氧時間及自身對于缺氧的耐受性有關。第三章光化學栓塞法建立缺血性腦卒中動物模型背景:實驗性缺血性腦卒中動物模型作為研究缺血性腦卒中病理機制以及研究開發(fā)新治療方案必不可少的工具,光化學栓塞法制作缺血性腦卒中動物模型操作簡便,穩(wěn)定性好,重復性高,研究人員可以針對性的控制梗死灶的位置以及大小,是研究缺血性腦卒中病理機制的良好選擇。目的:建立光栓法缺血性腦卒中動物模型,對比分析性別差異在缺血性腦卒中后梗死體積以及行為學表現的異同。方法:實驗組分為病理學檢測其中模型組(n=3)、假手術組(n=3)各組于建模第7d行尼氏染色和Fluoro-Jade C染色觀察梗死后病理學變化;梗死體積測試組:其中雌性組(n=8)、雄性組(n=8)各組于建模第7d行計算梗死體積大小;行為學測試組:雌性假手術組(n=10),雌性模型組(n=10),雄性假手術組(n=10),雄性模型組(n=9)各組于建模后1、2、3、5、7d行疲勞轉棒測試和前肢抓力測試。假手術組小鼠不注射孟加拉玫瑰紅,其余步驟同模型組。結果與討論:尼氏染色可見梗死中心神經元變性壞死,空泡樣病理改變,Fluoro-Jade C染色可見變性神經元陽性表達,雌性組梗死體積顯著小于雄性組,模型組行為學運動功能受損程度顯著大于假手術組,其中雌性組運動功能受損程度小于雄性組。以上結果表明光栓法可以成功建立缺血性腦卒中動物模型,且相同實驗室參數前提下,缺血性腦卒中對于雄性造成的神經功能損傷更為嚴重。第四章神經干細胞移植促進光化學栓塞動物模型的運動行為功能恢復背景:缺血性腦卒中為各種原因所致的腦部血液供應障礙,導致局部腦組織缺血缺氧性壞死,而出現相應神經功能缺損的一類臨床綜合征。是危害中老年人身體健康和生命的主要疾病之一。在過去幾十年中,其發(fā)病率和死亡率持續(xù)性增加,尤其在發(fā)展中國家給患者和家屬帶來了嚴重的精神和經濟負擔。從新生小鼠海馬分離出的具有向神經元以及膠質細胞分化能力的神經干細胞,為缺血性腦卒中的治療方式帶來的新的曙光。目的:觀察神經干細胞移植治療光化學栓塞腦卒中模型的效果。方法:實驗組分為病理學檢測組其中移植組(n=6)、假手術組(n=6)各組于移植后7d行尼氏染色和Fluoro-Jade C染色觀察梗死后病理學變化;梗死體積測試組:其中神經干細胞移植組(n=6)、假手術組(n=6)各組于移植后第7d行計算梗死體積大小;行為學測試組:雄性神經干細胞移植組(n=10),雄性假手術組(n=10),雄性模型組(n=10)各組于建模后1、2、3、5、7、14、21、28d行疲勞轉棒測試和前肢抓力測試。假手術組小鼠不注射孟加拉玫瑰紅,其余步驟同模型組。結果與討論:尼氏染色結果顯示較假手術組,移植組梗死體積顯著降低16.32%。(假手術組:27.93±2.8mm3,n=6,神經干細胞移植組:23.37±2.25mm3,n=6,p0.05)。此外,行為學測試中,神經干細胞移植組運動功能表現顯著高于假手術組及對照組。說明神經干細胞移植是一種治療缺血性腦卒中的有效治療手段。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R743.3

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