【摘要】：膠質(zhì)瘤是腦部最常見的惡性腫瘤,盡管手術(shù)最大切除加放療和化療,但復(fù)發(fā)幾乎不可避免,預(yù)后極差,平均生存期只有15-18個月。氬氦冷凍是近年來興起的一種新的腫瘤微創(chuàng)靶向治療手段,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種腫瘤的治療,比如前列腺癌、腎癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌及膠質(zhì)瘤等。與單純手術(shù)切除相比,冷凍治療除了對腫瘤組織產(chǎn)生局部破壞以外,也可引起機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)并可減少腫瘤的轉(zhuǎn)移,從而減少腫瘤的復(fù)發(fā)率。 一直以來,中樞神經(jīng)系統(tǒng)由于血腦屏障的存在,缺乏傳統(tǒng)的淋巴管,MHC低表達及T淋巴細(xì)胞較少而被認(rèn)為是免疫豁免區(qū)。然而,隨著對中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫的不斷研究,中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫豁免不是絕對的,現(xiàn)在更多的是把中樞神經(jīng)系統(tǒng)看成一個免疫特區(qū),并可分為三部分：腦實質(zhì)、腦室包括脈絡(luò)從和腦脊液及腦膜。而腦室和腦膜的免疫反應(yīng)與外周組織相似。因此,中樞神經(jīng)系統(tǒng)可以產(chǎn)生免疫反應(yīng),這為中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的免疫治療提供了理論基礎(chǔ)。越來越多的數(shù)據(jù)表明,樹突狀細(xì)胞(DC)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫反應(yīng)中起著重要作用。 樹突狀細(xì)胞是機體最強的抗原提呈細(xì)胞(APC),可有效提呈抗原并活化初始T細(xì)胞而產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng),是腫瘤免疫反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。正常情況下,DC以未成熟的狀態(tài)存在于外周組織,未成熟DC吞噬抗原后將其加工、處理為抗原肽,載入MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ類分子形成抗原肽-MHC分子復(fù)合物并表達于DC的表面,同時上調(diào)DC表面共刺激分子(CD80、CD86),黏附分子的表達形成成熟DC后,可識別并激活腫瘤抗原特異性T細(xì)胞,同時DC分泌IL-12等細(xì)胞因子而刺激T淋巴細(xì)胞增值,產(chǎn)生腫瘤殺傷效應(yīng)。 氬氦冷凍治療腫瘤后,局部形成大量壞死組織,這些壞死組織作為腫瘤抗原被DC攝取,進一步促進T淋巴細(xì)胞活化增值是產(chǎn)生腫瘤特異性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵。研究表明,氬氦冷凍是產(chǎn)生組織壞死的一種有效方法,細(xì)胞壞死包括細(xì)胞膜及胞質(zhì)的破裂及細(xì)胞器的釋放。此過程對于體內(nèi)免疫細(xì)胞是一個很強的活化信號。同時壞死又使細(xì)胞因子大量釋放,使得抗原遞呈細(xì)胞被活化的可能性增加。與傳統(tǒng)熱療不同,冷凍療法并不會對腫瘤內(nèi)部的抗原肽產(chǎn)生大的破壞。這些相對較完整的腫瘤特異性抗原肽隨著腫瘤細(xì)胞的裂解被釋放到周圍組織中,極易被體內(nèi)抗原呈遞細(xì)胞攝取并呈遞給T淋巴細(xì)胞從而產(chǎn)生細(xì)胞免疫效應(yīng)。近年來大量體內(nèi)外的實驗研究表明,腫瘤組織冷凍消融后的凍融產(chǎn)物可促進DC的成熟及其抗原遞呈功能,并可有效激活T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)。 目前,腫瘤抗原致敏DC后形成的DC疫苗已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床并取得了較好的療效。DC疫苗的主要制備方法包括腫瘤抗原多肽致敏DC、腫瘤細(xì)胞的蛋白提取物致敏DC、DC與腫瘤細(xì)胞互相融合、腫瘤細(xì)胞提取的DNA或mRNA致敏DC、細(xì)胞因子或趨化因子基因修飾DC等。理想的腫瘤抗原DC疫苗應(yīng)當(dāng)是能夠誘導(dǎo)針對多種腫瘤抗原表位的多克隆反應(yīng),而且不誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng),無安全隱患,不受患者MHC的限制,制備和應(yīng)用簡單方便。而采用腫瘤細(xì)胞的裂解物致敏DC,可以克服因單一抗原誘發(fā)的免疫反應(yīng)不能完全殺滅腫瘤細(xì)胞的缺陷,因此采用凍融裂解腫瘤細(xì)胞致敏DC制備的DC疫苗具有較好的應(yīng)用前景。 因此,基于樹突細(xì)胞具強大的抗原呈遞能力,本研究選用小鼠GL261膠質(zhì)瘤細(xì)胞系作為研究對象,首先,利用氬氦冷凍凍融膠質(zhì)瘤細(xì)胞,提取腫瘤抗原,致敏C57BL/6小鼠骨髓源DC,流式細(xì)胞儀檢測DC表面分子的表達,證明凍融產(chǎn)物是否可促進DC的成熟,同時檢測DC分泌的細(xì)胞因子的變化。提取小鼠骨髓T細(xì)胞與DC共培養(yǎng),檢測T細(xì)胞的增值活性,同時檢測T細(xì)胞分泌IFN-γ的含量,以評價DC細(xì)胞的抗原遞呈功能。將活化T細(xì)胞與GL261膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng),檢測不同效靶比時T細(xì)胞對GL261膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷率,觀察T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。 第一部分C57BL/6小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定 目的：探討分離和培養(yǎng)C57BL/6小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞(DC)的方法,并對其細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表面標(biāo)志物進行檢測,為樹突狀細(xì)胞的膠質(zhì)瘤免疫治療提供可靠的細(xì)胞來源。 方法：獲取C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞,聯(lián)合應(yīng)用粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細(xì)胞介素4(IL-4)細(xì)胞因子對其進行誘導(dǎo)培養(yǎng),培養(yǎng)第5天時添加腫瘤壞死因子a(TNF-a)促使其成熟。收集第5天和第8天非貼壁細(xì)胞,倒置顯微鏡觀察其細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,流式細(xì)胞儀檢測其表面分子CD80、CD86、MHC-Ⅰ及MHC-Ⅱ的表達。 結(jié)果：利用GM-CSF和IL-4可以從C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞中誘導(dǎo)培養(yǎng)出DC,培養(yǎng)第8天可見到典型的DC細(xì)胞形態(tài)。培養(yǎng)第5天未成熟DC的CD80、CD86、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ表達率分別為CD8011.98%, CD864.08%, MHC-Ⅰ6.90%, MHC-Ⅱ37.68%;培養(yǎng)第8天成熟DC的CD80、CD86、MHC-I和MHC-Ⅱ表達率分別為CD8097.40%, CD8691.99%, MHC-Ⅰ97.25%, MHC-Ⅱ98.71%。 結(jié)論：利用GM-CSF和IL-4可以從C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞中誘導(dǎo)培養(yǎng),可獲取足量高純度的DC,為DC的腫瘤免疫治療提供了細(xì)胞來源。 第二部分腫瘤抗原致敏DC誘導(dǎo)腫瘤殺傷效應(yīng)的實驗研究 目的：探討氬氦冷凍膠質(zhì)瘤細(xì)胞凍融產(chǎn)物對C57BL/6小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞(DC)成熟的影響,以及致敏DC誘導(dǎo)腫瘤殺傷效應(yīng)的作用機制。 方法：采用氬氦冷凍法凍融GL261膠質(zhì)瘤細(xì)胞為實驗組,只插入探針不冷凍為陰性對照組,凍融等量PBS為空白對照組,采用BCA法測定凍融產(chǎn)物蛋白濃度；體外誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞為DC,加入凍融產(chǎn)物后觀察其形態(tài)學(xué)變化。流式細(xì)胞儀檢測DCs表面CD80、CD86、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的表達。ELISA檢測其上清液中IL-6, IL-1β, tumor necrosis factor (TNF)-a, IL-12含量；提取脾臟T細(xì)胞,與DC共培養(yǎng)后CCK-8檢測DC與T細(xì)胞比為1：10、1：20、1：40、1：80時T細(xì)胞的增值活性及分泌IFN-y的量；以GL261細(xì)胞為靶細(xì)胞,以各組凍融抗原致敏DC活化的T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞,效靶比分別為5：1、10：1、50：1和100：1時CCK-8法檢測DC激活的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)對GL261膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷率。 結(jié)果：實驗組腫瘤抗原量高于陰性對照組及空白對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；實驗組具有典型成熟DC形態(tài),表型CD80、CD86、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的表達率及IL-6, IL-1β, tumor necrosis factor (TNF)-a, IL-12分泌量顯著高于陰性對照組及空白對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；DC與T細(xì)胞比為1：10、1：20時實驗組T細(xì)胞增值活性高,與陰性對照組及空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；實驗組DC與T細(xì)胞比為1：10、1：20、1：40、1：80時IFN-γ分泌量較高,與陰性對照組及空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；不同效靶比時實驗組CTLs對GL261細(xì)胞的殺傷率顯著高于陰性對照組及空白對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。 結(jié)論：氬氦冷凍膠質(zhì)瘤細(xì)胞可獲取大量腫瘤抗原并可促進DC成熟,凍融產(chǎn)物致敏DC后可有效負(fù)載腫瘤抗原而產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng),為氬氦冷凍靶免疫治療膠質(zhì)瘤提供了實驗基礎(chǔ)及理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41

【參考文獻】

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本文編號：2438270