【摘要】：膠質瘤是腦部最常見的惡性腫瘤,盡管手術最大切除加放療和化療,但復發(fā)幾乎不可避免,預后極差,平均生存期只有15-18個月。氬氦冷凍是近年來興起的一種新的腫瘤微創(chuàng)靶向治療手段,已經廣泛應用于各種腫瘤的治療,比如前列腺癌、腎癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌及膠質瘤等。與單純手術切除相比,冷凍治療除了對腫瘤組織產生局部破壞以外,也可引起機體的抗腫瘤免疫反應并可減少腫瘤的轉移,從而減少腫瘤的復發(fā)率。 一直以來,中樞神經系統由于血腦屏障的存在,缺乏傳統的淋巴管,MHC低表達及T淋巴細胞較少而被認為是免疫豁免區(qū)。然而,隨著對中樞神經系統免疫的不斷研究,中樞神經系統的免疫豁免不是絕對的,現在更多的是把中樞神經系統看成一個免疫特區(qū),并可分為三部分：腦實質、腦室包括脈絡從和腦脊液及腦膜。而腦室和腦膜的免疫反應與外周組織相似。因此,中樞神經系統可以產生免疫反應,這為中樞神經系統腫瘤的免疫治療提供了理論基礎。越來越多的數據表明,樹突狀細胞(DC)在中樞神經系統免疫反應中起著重要作用。 樹突狀細胞是機體最強的抗原提呈細胞(APC),可有效提呈抗原并活化初始T細胞而產生抗腫瘤免疫反應,是腫瘤免疫反應的關鍵環(huán)節(jié)。正常情況下,DC以未成熟的狀態(tài)存在于外周組織,未成熟DC吞噬抗原后將其加工、處理為抗原肽,載入MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ類分子形成抗原肽-MHC分子復合物并表達于DC的表面,同時上調DC表面共刺激分子(CD80、CD86),黏附分子的表達形成成熟DC后,可識別并激活腫瘤抗原特異性T細胞,同時DC分泌IL-12等細胞因子而刺激T淋巴細胞增值,產生腫瘤殺傷效應。 氬氦冷凍治療腫瘤后,局部形成大量壞死組織,這些壞死組織作為腫瘤抗原被DC攝取,進一步促進T淋巴細胞活化增值是產生腫瘤特異性免疫反應的關鍵。研究表明,氬氦冷凍是產生組織壞死的一種有效方法,細胞壞死包括細胞膜及胞質的破裂及細胞器的釋放。此過程對于體內免疫細胞是一個很強的活化信號。同時壞死又使細胞因子大量釋放,使得抗原遞呈細胞被活化的可能性增加。與傳統熱療不同,冷凍療法并不會對腫瘤內部的抗原肽產生大的破壞。這些相對較完整的腫瘤特異性抗原肽隨著腫瘤細胞的裂解被釋放到周圍組織中,極易被體內抗原呈遞細胞攝取并呈遞給T淋巴細胞從而產生細胞免疫效應。近年來大量體內外的實驗研究表明,腫瘤組織冷凍消融后的凍融產物可促進DC的成熟及其抗原遞呈功能,并可有效激活T淋巴細胞產生抗腫瘤免疫反應。 目前,腫瘤抗原致敏DC后形成的DC疫苗已經廣泛應用于臨床并取得了較好的療效。DC疫苗的主要制備方法包括腫瘤抗原多肽致敏DC、腫瘤細胞的蛋白提取物致敏DC、DC與腫瘤細胞互相融合、腫瘤細胞提取的DNA或mRNA致敏DC、細胞因子或趨化因子基因修飾DC等。理想的腫瘤抗原DC疫苗應當是能夠誘導針對多種腫瘤抗原表位的多克隆反應,而且不誘導自身免疫反應,無安全隱患,不受患者MHC的限制,制備和應用簡單方便。而采用腫瘤細胞的裂解物致敏DC,可以克服因單一抗原誘發(fā)的免疫反應不能完全殺滅腫瘤細胞的缺陷,因此采用凍融裂解腫瘤細胞致敏DC制備的DC疫苗具有較好的應用前景。 因此,基于樹突細胞具強大的抗原呈遞能力,本研究選用小鼠GL261膠質瘤細胞系作為研究對象,首先,利用氬氦冷凍凍融膠質瘤細胞,提取腫瘤抗原,致敏C57BL/6小鼠骨髓源DC,流式細胞儀檢測DC表面分子的表達,證明凍融產物是否可促進DC的成熟,同時檢測DC分泌的細胞因子的變化。提取小鼠骨髓T細胞與DC共培養(yǎng),檢測T細胞的增值活性,同時檢測T細胞分泌IFN-γ的含量,以評價DC細胞的抗原遞呈功能。將活化T細胞與GL261膠質瘤細胞共培養(yǎng),檢測不同效靶比時T細胞對GL261膠質瘤細胞的殺傷率,觀察T細胞對腫瘤細胞的殺傷效應。 第一部分C57BL/6小鼠骨髓源樹突狀細胞的培養(yǎng)和鑒定 目的：探討分離和培養(yǎng)C57BL/6小鼠骨髓樹突狀細胞(DC)的方法,并對其細胞形態(tài)學、細胞表面標志物進行檢測,為樹突狀細胞的膠質瘤免疫治療提供可靠的細胞來源。 方法：獲取C57BL/6小鼠骨髓細胞,聯合應用粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細胞介素4(IL-4)細胞因子對其進行誘導培養(yǎng),培養(yǎng)第5天時添加腫瘤壞死因子a(TNF-a)促使其成熟。收集第5天和第8天非貼壁細胞,倒置顯微鏡觀察其細胞形態(tài)學變化,流式細胞儀檢測其表面分子CD80、CD86、MHC-Ⅰ及MHC-Ⅱ的表達。 結果：利用GM-CSF和IL-4可以從C57BL/6小鼠骨髓細胞中誘導培養(yǎng)出DC,培養(yǎng)第8天可見到典型的DC細胞形態(tài)。培養(yǎng)第5天未成熟DC的CD80、CD86、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ表達率分別為CD8011.98%, CD864.08%, MHC-Ⅰ6.90%, MHC-Ⅱ37.68%;培養(yǎng)第8天成熟DC的CD80、CD86、MHC-I和MHC-Ⅱ表達率分別為CD8097.40%, CD8691.99%, MHC-Ⅰ97.25%, MHC-Ⅱ98.71%。 結論：利用GM-CSF和IL-4可以從C57BL/6小鼠骨髓細胞中誘導培養(yǎng),可獲取足量高純度的DC,為DC的腫瘤免疫治療提供了細胞來源。 第二部分腫瘤抗原致敏DC誘導腫瘤殺傷效應的實驗研究 目的：探討氬氦冷凍膠質瘤細胞凍融產物對C57BL/6小鼠骨髓源樹突狀細胞(DC)成熟的影響,以及致敏DC誘導腫瘤殺傷效應的作用機制。 方法：采用氬氦冷凍法凍融GL261膠質瘤細胞為實驗組,只插入探針不冷凍為陰性對照組,凍融等量PBS為空白對照組,采用BCA法測定凍融產物蛋白濃度；體外誘導小鼠骨髓細胞為DC,加入凍融產物后觀察其形態(tài)學變化。流式細胞儀檢測DCs表面CD80、CD86、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的表達。ELISA檢測其上清液中IL-6, IL-1β, tumor necrosis factor (TNF)-a, IL-12含量；提取脾臟T細胞,與DC共培養(yǎng)后CCK-8檢測DC與T細胞比為1：10、1：20、1：40、1：80時T細胞的增值活性及分泌IFN-y的量；以GL261細胞為靶細胞,以各組凍融抗原致敏DC活化的T細胞作為效應細胞,效靶比分別為5：1、10：1、50：1和100：1時CCK-8法檢測DC激活的細胞毒性T細胞(CTL)對GL261膠質瘤細胞的殺傷率。 結果：實驗組腫瘤抗原量高于陰性對照組及空白對照組,差異有統計學意義(P0.01)；實驗組具有典型成熟DC形態(tài),表型CD80、CD86、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的表達率及IL-6, IL-1β, tumor necrosis factor (TNF)-a, IL-12分泌量顯著高于陰性對照組及空白對照組,差異有統計學意義(P0.01)；DC與T細胞比為1：10、1：20時實驗組T細胞增值活性高,與陰性對照組及空白對照組相比差異有統計學意義(P0.01)；實驗組DC與T細胞比為1：10、1：20、1：40、1：80時IFN-γ分泌量較高,與陰性對照組及空白對照組相比差異有統計學意義(P0.01)；不同效靶比時實驗組CTLs對GL261細胞的殺傷率顯著高于陰性對照組及空白對照組,差異有統計學意義(P0.01)。 結論：氬氦冷凍膠質瘤細胞可獲取大量腫瘤抗原并可促進DC成熟,凍融產物致敏DC后可有效負載腫瘤抗原而產生抗腫瘤效應,為氬氦冷凍靶免疫治療膠質瘤提供了實驗基礎及理論依據。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41

【參考文獻】

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本文編號：2438270