【摘要】：第一部分原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元無鎂癲癇模型建立及miRNA132/p250GAP表達(dá)測定目的:神經(jīng)元突觸重塑及病理性放電環(huán)路形成是癲癇形成中最重要的病理改變,其機(jī)制研究及抑制突觸重塑的有效靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)對新的抗癲癇藥物的發(fā)現(xiàn)意義重大。miRNA132通過調(diào)節(jié)蛋白p250GAP表達(dá)在未成熟神經(jīng)元突觸發(fā)育重塑過程中起到十分重要的作用。本實(shí)驗(yàn)首先建立原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元癲癇模型,通過測定miRNA132/p250GAP在正常及癲癇海馬神經(jīng)元中的表達(dá)規(guī)律,探索miRNA132/p250GAP是否與癲癇活動相關(guān)。方法:1.孕16-18天C57BL/6小鼠,取海馬神經(jīng)元進(jìn)行原代培養(yǎng),使用無血清培養(yǎng)基Neurobasal加神經(jīng)生長營養(yǎng)因子B27培養(yǎng)神經(jīng)元。2.原代海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)至第7天時(shí)用神經(jīng)元特異性抗體MAP2采用免疫熒光方法鑒定神經(jīng)元,并計(jì)算培養(yǎng)純度。3.原代培養(yǎng)至第10天時(shí)使用無鎂細(xì)胞外液處理的方法建立癲癇細(xì)胞模型,全細(xì)胞膜片鉗記錄神經(jīng)元膜電位,檢測細(xì)胞癲癇模型是否建立成功。4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫印跡方法分別測定miRNA132和p250GAP在正常培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元及癲癇建模后表達(dá)規(guī)律。結(jié)果:1.成功原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元,細(xì)胞培養(yǎng)至第15天,狀態(tài)良好。2.MAP2免疫熒光鑒定培養(yǎng)細(xì)胞為神經(jīng)元,培養(yǎng)純度達(dá)到98%以上。3.無鎂細(xì)胞外液處理3小時(shí)后行全細(xì)胞膜片鉗,無鎂處理組神經(jīng)元均記錄到自發(fā)性反復(fù)癲癇樣放電說明培養(yǎng)神經(jīng)元癲癇模型建立成功。4.miRNA132表達(dá)水平在原代培養(yǎng)5-15天逐漸增加,癲癇模型建立后6小時(shí)至第7天miRNA132表達(dá)水平較非癲癇對照組增加,在6小時(shí)、3天、7天時(shí)有顯著性。p250GAP表達(dá)水平在原代培養(yǎng)5-15天逐漸減少,癲癇模型建立后6小時(shí)至第7天p250GAP表達(dá)水平較對照組減少,在3天、5天時(shí)有顯著性。結(jié)論:原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞癲癇模型建立成功,miRNA132表達(dá)水平在正常培養(yǎng)原代神經(jīng)元中逐漸升高且在癲癇模型中進(jìn)一步上調(diào),而其靶蛋白p250GAP表達(dá)水平在正常培養(yǎng)原代神經(jīng)元中逐漸降低且在癲癇模型中進(jìn)一步下調(diào),說明miRNA132和p250GAP表達(dá)和神經(jīng)元癲癇活動可能密切相關(guān)。第二部分MiRNA132對培養(yǎng)癲癇神經(jīng)元電興奮性及凋亡水平影響及可能機(jī)制目的:在原代培養(yǎng)海馬癲癇神經(jīng)元中通過干預(yù)miRNA132表達(dá)研究其對神經(jīng)元電興奮性和神經(jīng)元凋亡的影響,并通過對其靶蛋白p250GAP干預(yù)深入研究miRNA132是否通過影響其靶蛋白p250GAP表達(dá)起到上述調(diào)節(jié)作用。方法:1.miRNA132特異性拮抗劑ant-132及p250GAP沉默慢病毒LV-shp250GAP構(gòu)建,原代神經(jīng)元最佳轉(zhuǎn)染條件測定。2.在培養(yǎng)癲癇神經(jīng)元中測定miRNA132表達(dá)沉默對p250GAP蛋白表達(dá)影響。3.在培養(yǎng)癲癇神經(jīng)元中測定miRNA132表達(dá)沉默對神經(jīng)元電興奮性影響,并通過同時(shí)干預(yù)p250GAP蛋白探討miRNA132是否通過p250GAP起到上述作用。4.在培養(yǎng)癲癇神經(jīng)元中測定Rho GTP酶Rac1和Cdc42活性,并通過干預(yù)miRNA132及p250GAP表達(dá)探討他們是否在癲癇細(xì)胞模型中對Rho GTP酶Rac1和Cdc42活性產(chǎn)生影響。5.Tunel原位凋亡檢測法在培養(yǎng)癲癇神經(jīng)元中測定miRNA132表達(dá)沉默對神經(jīng)元凋亡的影響。結(jié)果:1.Ant-132最佳轉(zhuǎn)染濃度1n M,轉(zhuǎn)染后miRNA132表達(dá)明顯被抑制,且轉(zhuǎn)染后神經(jīng)元生長狀態(tài)良好;LV-shp250GAP最佳轉(zhuǎn)染MOI=10,轉(zhuǎn)染后p250GAP表達(dá)被明顯抑制,且轉(zhuǎn)染后神經(jīng)元生長狀態(tài)良好。2.培養(yǎng)癲癇神經(jīng)元中miRNA132表達(dá)沉默后p250GAP蛋白表達(dá)明顯增加。3.培養(yǎng)海馬神經(jīng)元在ant-132干預(yù)之后經(jīng)無鎂細(xì)胞外液處理成功誘導(dǎo)出現(xiàn)自發(fā)性反復(fù)癲癇樣放電(spontaneous recurrent epileptiform discharges,SREDs)異常放電的細(xì)胞比例與未經(jīng)ant-132干預(yù)對照組相比明顯降低,同時(shí)誘導(dǎo)SREDs異常放電的神經(jīng)元其動作電位頻率在ant-132干預(yù)組也明顯降低;培養(yǎng)海馬神經(jīng)元在經(jīng)ant-132及慢病毒同時(shí)干預(yù)miRNA132及p250GAP蛋白表達(dá)之后無鎂細(xì)胞外液處理成功誘導(dǎo)出現(xiàn)SREDs異常放電的細(xì)胞比例與未經(jīng)ant-132干預(yù)對照組相比雖然無明顯差異,但與ant-132干預(yù)組相比明顯升高,同時(shí)誘導(dǎo)SRED異常放電的神經(jīng)元其動作電位頻率在ant-132及LV-shp250GAP同時(shí)干預(yù)組與未干預(yù)組及ant-132干預(yù)相比都明顯升高。4.培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元中癲癇組比非癲癇對照組Racl及Cdc42活性水平升高;miRNA132表達(dá)沉默后Racl活性水平無明顯變化,而Cdc42活性明顯降低;同時(shí)抑制p250GAP表達(dá)Racl活性水平仍無明顯變化,而Cdc42活性明顯降低。5.培養(yǎng)癲癇神經(jīng)元比非癲癇神經(jīng)元凋亡明顯增加,而在癲癇模型中抑制miRNA132表達(dá)之后神經(jīng)元凋亡明顯減少。結(jié)論:1.Ant-132及p250GAP沉默慢病毒能有效抑制miRNA132及p250GAP表達(dá)。2.在細(xì)胞癲癇模型中miRNA132仍對其靶蛋白p250GAP表達(dá)有調(diào)控作用。3.在細(xì)胞癲癇模型中miRNA132可以通過影響p250GAP表達(dá)調(diào)節(jié)神經(jīng)元電興奮性。4.在細(xì)胞癲癇模型中miRNA132可以通過影響p250GAP表達(dá)調(diào)節(jié)下游Rho GTP酶Cdc42活性,但對Rac1活性無影響,miRNA132/p250GAP可能主要是通過調(diào)節(jié)下游Cdc42活性來調(diào)控細(xì)胞骨架肌動蛋白聚合與解聚并對棘突、突觸重塑癲癇病理性環(huán)路形成等起到調(diào)節(jié)作用的。5.在細(xì)胞癲癇模型中抑制miRNA132高表達(dá)能減少細(xì)胞凋亡起到神經(jīng)元保護(hù)作用。第三部分miRNA132對慢性癲癇模型小鼠行為學(xué)及棘突重塑影響目的:在在體實(shí)驗(yàn)中通過建立難治性顳葉癲癇模型并通過干預(yù)miRNA132表達(dá)分析其對模型慢性期癲癇形成行為學(xué)的影響以及模型中腦組織海馬神經(jīng)元棘突形態(tài)及密度的影響。方法:1.顳葉慢性癲癇模型建立,C57BL/6小鼠鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)后隨機(jī)分為癲癇組(EP)、miRNA132無意義序列干預(yù)組(EP+scr-132)及miRNA132干預(yù)組(EP+ant-132),在60天內(nèi)觀察各組慢性自發(fā)發(fā)作的潛伏期及自發(fā)發(fā)作頻率并進(jìn)行比較。2.行為學(xué)觀察結(jié)束后,所有有慢性自發(fā)發(fā)作小鼠海馬通過高爾基染色分析齒狀回區(qū)域棘突密度并分別分析不同形態(tài)(絲狀偽足、瘦長型棘突、短粗型棘突、蘑菇型棘突)棘突密度。結(jié)果:1.miRNA132表達(dá)抑制后對模型小鼠慢性自發(fā)發(fā)作行為學(xué)影響:EP組平均潛伏期為14.0±4.39天,EP+scr-132組平均潛伏期14.57±2.63天,EP+scr-132組平均潛伏期20.40±4.05天,與miRNA無意義序列干預(yù)組相比,ant-132干預(yù)組潛伏期明顯延長;于建模后第6周連續(xù)7天觀察并統(tǒng)計(jì)各組發(fā)作頻次,EP組平均發(fā)作2.32±0.60次/天,EP+scr-132組平均發(fā)作2.24±0.84次/天,EP+ant-132組平均發(fā)作0.94±0.26次/天,與未干預(yù)及miRNA無意義序列干預(yù)組相比,ant-132干預(yù)組慢性自發(fā)發(fā)作頻率明顯減少。2.miRNA132表達(dá)抑制后小鼠海馬齒狀回區(qū)神經(jīng)元棘突密度減少,EP組平均密度11.59±0.38個(gè)/15μm,EP+scr-132組平均密度10.98±1.06個(gè)/15μm,EP+ant-132組平均密度8.93±0.56個(gè)/15μm,EP+ant-132組比EP組和EP+scr-132齒狀回區(qū)棘突密度減少;分別分析短粗型棘突、蘑菇型棘突、瘦長型棘突、絲狀偽足密度,EP組平均為1.39±0.49個(gè)/15μm、3.28±0.24個(gè)/15μm、2.59±0.22個(gè)/15μm、4.33±0.24個(gè)/15μm,EP+scr-132組平均為1.26±0.58個(gè)/15μm、2.92±0.22個(gè)/15μm、2.81±0.29個(gè)/15μm、3.99±0.54個(gè)/15μm,EP+ant-132組平均為1.87±0.58個(gè)/15μm、3.92±0.22個(gè)/15μm、1.11±0.19個(gè)/15μm、2.11±0.45個(gè)/15μm,與EP及EP+scr-132對照組相比EP+ant-132組絲狀偽足及瘦長型棘突相對減少,而蘑菇型棘突增加。結(jié)論:1.在鋰-匹羅卡品小鼠慢性癲癇模型中抑制海馬區(qū)miRNA132表達(dá)能夠延緩癲癇慢性發(fā)作形成,減輕發(fā)作頻率。2.在鋰-匹羅卡品小鼠慢性癲癇模型中抑制海馬區(qū)miRNA132表達(dá)能夠抑制棘突重塑增加功能穩(wěn)定型棘突比例,進(jìn)一步證明了miRNA132可能通過影響其靶蛋白p250GAP表達(dá)調(diào)節(jié)下游Rho GTP酶Cdc42活性參與癲癇形成中突觸重塑病理過程。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R742.1

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本文編號：2434179