【摘要】：第一部分原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元無鎂癲癇模型建立及miRNA132/p250GAP表達測定目的:神經(jīng)元突觸重塑及病理性放電環(huán)路形成是癲癇形成中最重要的病理改變,其機制研究及抑制突觸重塑的有效靶點的發(fā)現(xiàn)對新的抗癲癇藥物的發(fā)現(xiàn)意義重大。miRNA132通過調(diào)節(jié)蛋白p250GAP表達在未成熟神經(jīng)元突觸發(fā)育重塑過程中起到十分重要的作用。本實驗首先建立原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元癲癇模型,通過測定miRNA132/p250GAP在正常及癲癇海馬神經(jīng)元中的表達規(guī)律,探索miRNA132/p250GAP是否與癲癇活動相關。方法:1.孕16-18天C57BL/6小鼠,取海馬神經(jīng)元進行原代培養(yǎng),使用無血清培養(yǎng)基Neurobasal加神經(jīng)生長營養(yǎng)因子B27培養(yǎng)神經(jīng)元。2.原代海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)至第7天時用神經(jīng)元特異性抗體MAP2采用免疫熒光方法鑒定神經(jīng)元,并計算培養(yǎng)純度。3.原代培養(yǎng)至第10天時使用無鎂細胞外液處理的方法建立癲癇細胞模型,全細胞膜片鉗記錄神經(jīng)元膜電位,檢測細胞癲癇模型是否建立成功。4.實時熒光定量PCR、免疫印跡方法分別測定miRNA132和p250GAP在正常培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元及癲癇建模后表達規(guī)律。結果:1.成功原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元,細胞培養(yǎng)至第15天,狀態(tài)良好。2.MAP2免疫熒光鑒定培養(yǎng)細胞為神經(jīng)元,培養(yǎng)純度達到98%以上。3.無鎂細胞外液處理3小時后行全細胞膜片鉗,無鎂處理組神經(jīng)元均記錄到自發(fā)性反復癲癇樣放電說明培養(yǎng)神經(jīng)元癲癇模型建立成功。4.miRNA132表達水平在原代培養(yǎng)5-15天逐漸增加,癲癇模型建立后6小時至第7天miRNA132表達水平較非癲癇對照組增加,在6小時、3天、7天時有顯著性。p250GAP表達水平在原代培養(yǎng)5-15天逐漸減少,癲癇模型建立后6小時至第7天p250GAP表達水平較對照組減少,在3天、5天時有顯著性。結論:原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細胞癲癇模型建立成功,miRNA132表達水平在正常培養(yǎng)原代神經(jīng)元中逐漸升高且在癲癇模型中進一步上調(diào),而其靶蛋白p250GAP表達水平在正常培養(yǎng)原代神經(jīng)元中逐漸降低且在癲癇模型中進一步下調(diào),說明miRNA132和p250GAP表達和神經(jīng)元癲癇活動可能密切相關。第二部分MiRNA132對培養(yǎng)癲癇神經(jīng)元電興奮性及凋亡水平影響及可能機制目的:在原代培養(yǎng)海馬癲癇神經(jīng)元中通過干預miRNA132表達研究其對神經(jīng)元電興奮性和神經(jīng)元凋亡的影響,并通過對其靶蛋白p250GAP干預深入研究miRNA132是否通過影響其靶蛋白p250GAP表達起到上述調(diào)節(jié)作用。方法:1.miRNA132特異性拮抗劑ant-132及p250GAP沉默慢病毒LV-shp250GAP構建,原代神經(jīng)元最佳轉染條件測定。2.在培養(yǎng)癲癇神經(jīng)元中測定miRNA132表達沉默對p250GAP蛋白表達影響。3.在培養(yǎng)癲癇神經(jīng)元中測定miRNA132表達沉默對神經(jīng)元電興奮性影響,并通過同時干預p250GAP蛋白探討miRNA132是否通過p250GAP起到上述作用。4.在培養(yǎng)癲癇神經(jīng)元中測定Rho GTP酶Rac1和Cdc42活性,并通過干預miRNA132及p250GAP表達探討他們是否在癲癇細胞模型中對Rho GTP酶Rac1和Cdc42活性產(chǎn)生影響。5.Tunel原位凋亡檢測法在培養(yǎng)癲癇神經(jīng)元中測定miRNA132表達沉默對神經(jīng)元凋亡的影響。結果:1.Ant-132最佳轉染濃度1n M,轉染后miRNA132表達明顯被抑制,且轉染后神經(jīng)元生長狀態(tài)良好;LV-shp250GAP最佳轉染MOI=10,轉染后p250GAP表達被明顯抑制,且轉染后神經(jīng)元生長狀態(tài)良好。2.培養(yǎng)癲癇神經(jīng)元中miRNA132表達沉默后p250GAP蛋白表達明顯增加。3.培養(yǎng)海馬神經(jīng)元在ant-132干預之后經(jīng)無鎂細胞外液處理成功誘導出現(xiàn)自發(fā)性反復癲癇樣放電(spontaneous recurrent epileptiform discharges,SREDs)異常放電的細胞比例與未經(jīng)ant-132干預對照組相比明顯降低,同時誘導SREDs異常放電的神經(jīng)元其動作電位頻率在ant-132干預組也明顯降低;培養(yǎng)海馬神經(jīng)元在經(jīng)ant-132及慢病毒同時干預miRNA132及p250GAP蛋白表達之后無鎂細胞外液處理成功誘導出現(xiàn)SREDs異常放電的細胞比例與未經(jīng)ant-132干預對照組相比雖然無明顯差異,但與ant-132干預組相比明顯升高,同時誘導SRED異常放電的神經(jīng)元其動作電位頻率在ant-132及LV-shp250GAP同時干預組與未干預組及ant-132干預相比都明顯升高。4.培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元中癲癇組比非癲癇對照組Racl及Cdc42活性水平升高;miRNA132表達沉默后Racl活性水平無明顯變化,而Cdc42活性明顯降低;同時抑制p250GAP表達Racl活性水平仍無明顯變化,而Cdc42活性明顯降低。5.培養(yǎng)癲癇神經(jīng)元比非癲癇神經(jīng)元凋亡明顯增加,而在癲癇模型中抑制miRNA132表達之后神經(jīng)元凋亡明顯減少。結論:1.Ant-132及p250GAP沉默慢病毒能有效抑制miRNA132及p250GAP表達。2.在細胞癲癇模型中miRNA132仍對其靶蛋白p250GAP表達有調(diào)控作用。3.在細胞癲癇模型中miRNA132可以通過影響p250GAP表達調(diào)節(jié)神經(jīng)元電興奮性。4.在細胞癲癇模型中miRNA132可以通過影響p250GAP表達調(diào)節(jié)下游Rho GTP酶Cdc42活性,但對Rac1活性無影響,miRNA132/p250GAP可能主要是通過調(diào)節(jié)下游Cdc42活性來調(diào)控細胞骨架肌動蛋白聚合與解聚并對棘突、突觸重塑癲癇病理性環(huán)路形成等起到調(diào)節(jié)作用的。5.在細胞癲癇模型中抑制miRNA132高表達能減少細胞凋亡起到神經(jīng)元保護作用。第三部分miRNA132對慢性癲癇模型小鼠行為學及棘突重塑影響目的:在在體實驗中通過建立難治性顳葉癲癇模型并通過干預miRNA132表達分析其對模型慢性期癲癇形成行為學的影響以及模型中腦組織海馬神經(jīng)元棘突形態(tài)及密度的影響。方法:1.顳葉慢性癲癇模型建立,C57BL/6小鼠鋰-匹羅卡品誘導癲癇持續(xù)狀態(tài)后隨機分為癲癇組(EP)、miRNA132無意義序列干預組(EP+scr-132)及miRNA132干預組(EP+ant-132),在60天內(nèi)觀察各組慢性自發(fā)發(fā)作的潛伏期及自發(fā)發(fā)作頻率并進行比較。2.行為學觀察結束后,所有有慢性自發(fā)發(fā)作小鼠海馬通過高爾基染色分析齒狀回區(qū)域棘突密度并分別分析不同形態(tài)(絲狀偽足、瘦長型棘突、短粗型棘突、蘑菇型棘突)棘突密度。結果:1.miRNA132表達抑制后對模型小鼠慢性自發(fā)發(fā)作行為學影響:EP組平均潛伏期為14.0±4.39天,EP+scr-132組平均潛伏期14.57±2.63天,EP+scr-132組平均潛伏期20.40±4.05天,與miRNA無意義序列干預組相比,ant-132干預組潛伏期明顯延長;于建模后第6周連續(xù)7天觀察并統(tǒng)計各組發(fā)作頻次,EP組平均發(fā)作2.32±0.60次/天,EP+scr-132組平均發(fā)作2.24±0.84次/天,EP+ant-132組平均發(fā)作0.94±0.26次/天,與未干預及miRNA無意義序列干預組相比,ant-132干預組慢性自發(fā)發(fā)作頻率明顯減少。2.miRNA132表達抑制后小鼠海馬齒狀回區(qū)神經(jīng)元棘突密度減少,EP組平均密度11.59±0.38個/15μm,EP+scr-132組平均密度10.98±1.06個/15μm,EP+ant-132組平均密度8.93±0.56個/15μm,EP+ant-132組比EP組和EP+scr-132齒狀回區(qū)棘突密度減少;分別分析短粗型棘突、蘑菇型棘突、瘦長型棘突、絲狀偽足密度,EP組平均為1.39±0.49個/15μm、3.28±0.24個/15μm、2.59±0.22個/15μm、4.33±0.24個/15μm,EP+scr-132組平均為1.26±0.58個/15μm、2.92±0.22個/15μm、2.81±0.29個/15μm、3.99±0.54個/15μm,EP+ant-132組平均為1.87±0.58個/15μm、3.92±0.22個/15μm、1.11±0.19個/15μm、2.11±0.45個/15μm,與EP及EP+scr-132對照組相比EP+ant-132組絲狀偽足及瘦長型棘突相對減少,而蘑菇型棘突增加。結論:1.在鋰-匹羅卡品小鼠慢性癲癇模型中抑制海馬區(qū)miRNA132表達能夠延緩癲癇慢性發(fā)作形成,減輕發(fā)作頻率。2.在鋰-匹羅卡品小鼠慢性癲癇模型中抑制海馬區(qū)miRNA132表達能夠抑制棘突重塑增加功能穩(wěn)定型棘突比例,進一步證明了miRNA132可能通過影響其靶蛋白p250GAP表達調(diào)節(jié)下游Rho GTP酶Cdc42活性參與癲癇形成中突觸重塑病理過程。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R742.1

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本文編號：2434179