【摘要】：第一部分血流動(dòng)力學(xué)誘導(dǎo)兔基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞表達(dá)譜變化的基因芯片研究目的:顱內(nèi)動(dòng)脈瘤是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病,動(dòng)脈瘤一旦破裂,致殘致死率較高。目前對(duì)于顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的治療主要有開(kāi)顱手術(shù)與血管內(nèi)治療。隨著技術(shù)的進(jìn)步,盡管治療的安全性越來(lái)越高,但是仍存在手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)。因此,探索動(dòng)脈瘤的無(wú)創(chuàng)治療成為一種新的思路。要尋找無(wú)創(chuàng)治療的靶點(diǎn)就要求我們對(duì)動(dòng)脈瘤的病因?qū)W開(kāi)展研究。目前關(guān)于動(dòng)脈瘤發(fā)生發(fā)展的主流研究觀點(diǎn)認(rèn)為,血流動(dòng)力學(xué)因素在其中有重要作用。關(guān)于兔顱內(nèi)動(dòng)脈瘤模型的文獻(xiàn)報(bào)道,結(jié)扎兔雙側(cè)頸總動(dòng)脈后,基底動(dòng)脈在高血流負(fù)荷條件下發(fā)生了顯著重構(gòu),但其中主要的細(xì)胞成分平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cells,SMCs)發(fā)生了怎樣的改變并不清楚。本研究應(yīng)用基因芯片技術(shù),對(duì)基底動(dòng)脈SMCs在血管重構(gòu)過(guò)程中基因表達(dá)譜進(jìn)行研究,探討血管在血流負(fù)荷下重構(gòu)的生物學(xué)過(guò)程,分析表達(dá)差異的基因,為下一步的研究提供線索。方法:新西蘭大白兔,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈,對(duì)照組暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈。5天后將新西蘭大白兔處死,應(yīng)用生理鹽水予以心臟灌注,開(kāi)顱取基底動(dòng)脈標(biāo)本。應(yīng)用酶消化法,分離基底動(dòng)脈SMCs。將平滑肌樣品抽提總RNA后,應(yīng)用Agilent rabbit 4×44K芯片進(jìn)行檢測(cè)。然后選取部分基因應(yīng)用Real-time PCR對(duì)芯片結(jié)果的可信性進(jìn)行驗(yàn)證。最后對(duì)所得差異基因進(jìn)行GO(Gene Ontology)分析及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。并對(duì)差異基因中包含的轉(zhuǎn)錄子進(jìn)行分析。結(jié)果:結(jié)扎兔雙側(cè)頸總動(dòng)脈5天后可見(jiàn)兔基底動(dòng)脈發(fā)生顯著重構(gòu),基底動(dòng)脈迂曲,直徑增大。芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)947個(gè)差異基因,其中實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,617個(gè)基因表達(dá)升高,330個(gè)基因表達(dá)降低。選取了PTHLH、ENPP1、IGF1等芯片結(jié)果提示發(fā)生改變的基因進(jìn)行了PCR的驗(yàn)證,結(jié)果顯示所有選取的基因在RNA水平上改變的趨勢(shì)與芯片的結(jié)果是一致的,這也證明了芯片結(jié)果的可靠性。對(duì)差異基因進(jìn)行GO分析顯示,在血流動(dòng)力學(xué)改變誘導(dǎo)兔基底動(dòng)脈重構(gòu)的過(guò)程中,差異基因主要參與細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞和細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程;參與組成細(xì)胞內(nèi)成分、細(xì)胞膜連接的細(xì)胞器;參與蛋白的結(jié)合等功能。KEGG通路分析結(jié)果顯示,血流動(dòng)力學(xué)誘導(dǎo)血管重構(gòu)時(shí),表達(dá)下調(diào)的基因主要與精氨酸和脯氨酸代謝相關(guān);表達(dá)上調(diào)的基因主要與細(xì)胞外受體之間的相互作用、局部的粘附等相關(guān)。另外,我們發(fā)現(xiàn)血流動(dòng)力學(xué)負(fù)荷誘導(dǎo)發(fā)生顯著改變的基因中,包含25個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,它們可能參與調(diào)控基因的表達(dá)。結(jié)論:兔基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在高血流負(fù)荷條件下,其基因表達(dá)發(fā)生了顯著變化。通過(guò)數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)了一些特定基因及轉(zhuǎn)錄因子可能在血流動(dòng)力學(xué)誘導(dǎo)的血管重構(gòu)中發(fā)揮重要作用。第二部分EGFR在血流動(dòng)力學(xué)誘導(dǎo)大鼠顱內(nèi)動(dòng)脈瘤生成中的作用及機(jī)制研究目的:本課題擬研究表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)對(duì)血流動(dòng)力學(xué)改變誘導(dǎo)大鼠顱內(nèi)動(dòng)脈瘤生成的影響,并探討EGFR對(duì)動(dòng)脈瘤生成中的作用機(jī)制。方法:SD大鼠隨機(jī)分為4組:空白對(duì)照組、動(dòng)脈瘤組、Erlotinib組(EGFR抑制劑組)、Erlotinib溶劑組。動(dòng)脈瘤組、Erlotinib組及Erlotinib溶劑組大鼠,均予以結(jié)扎左側(cè)頸外動(dòng)脈、左側(cè)翼顎動(dòng)脈及右側(cè)頸總動(dòng)脈,建立血流動(dòng)力學(xué)改變誘導(dǎo)大鼠顱內(nèi)動(dòng)脈瘤模型。對(duì)照組予以暴露上述血管,但不進(jìn)行結(jié)扎。2周后取空白對(duì)照組及動(dòng)脈瘤組大鼠的顱內(nèi)動(dòng)脈,對(duì)EGFR及EGFR的激活形式磷酸化EGFR(EGFR-P)進(jìn)行Western blot檢測(cè)。建模3個(gè)月后應(yīng)用血管鑄型劑(Batson’s#17),對(duì)大鼠進(jìn)行心臟灌注,獲取顱內(nèi)動(dòng)脈血管鑄型,并進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察,對(duì)各組成瘤率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。于3個(gè)月時(shí),應(yīng)用生理鹽水對(duì)大鼠進(jìn)行心臟灌注,獲取大鼠顱內(nèi)血管后提取RNA,并應(yīng)用PCR對(duì)MMP2、MMP9等動(dòng)脈瘤標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)建模3個(gè)月后應(yīng)用生理鹽水及多聚甲醛對(duì)大鼠進(jìn)行心臟灌注,獲取大鼠大腦組織,予以包埋、切片,并進(jìn)行HE染色、免疫組化和EVG染色等檢測(cè)。結(jié)果:建立動(dòng)脈瘤模型2周后,動(dòng)脈瘤組與對(duì)照組腦血管EGFR及EGFR-P的Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,EGFR表達(dá)在動(dòng)脈瘤組與對(duì)照組之間無(wú)明顯差異,EGFR-P在動(dòng)脈瘤組表達(dá)較對(duì)照組升高。各組大鼠腦血管鑄型結(jié)果顯示:3個(gè)月時(shí),動(dòng)脈瘤組在大鼠前交通部位有明顯動(dòng)脈瘤形成。Erlotinib組,動(dòng)脈瘤的成瘤率較動(dòng)脈瘤組低。各組血管標(biāo)本的HE及EVG染色結(jié)果顯示:動(dòng)脈瘤組較對(duì)照組,血管發(fā)生了顯著重構(gòu),血管內(nèi)膜褶皺較對(duì)照組明顯,血管壁較對(duì)照組增厚。Erlotinib組血管重構(gòu)較動(dòng)脈瘤組明顯減輕。免疫組化結(jié)果顯示:動(dòng)脈瘤組較空白對(duì)照組,MMP2、MMP9表達(dá)明顯升高。而Erlotinib組MMP2、MMP9表達(dá)較動(dòng)脈瘤組降低。Real-time PCR結(jié)果同樣顯示:動(dòng)脈瘤組MMP2、MMP9表達(dá)較空白對(duì)照組升高,Erlotinib組表達(dá)較動(dòng)脈瘤組降低。結(jié)論:在血流動(dòng)力學(xué)改變誘導(dǎo)大鼠顱內(nèi)動(dòng)脈瘤模型中,EGFR通路被激活。應(yīng)用Erlotinib阻斷EGFR可以減輕血流動(dòng)力學(xué)誘導(dǎo)大鼠顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的生成,其機(jī)制可能是通過(guò)抑制MMP2和MMP9的表達(dá),進(jìn)而減輕血管的重構(gòu)發(fā)揮作用的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R743

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本文編號(hào)：2422188