【摘要】：帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一,中老年人的發(fā)病率較高,被稱為威脅中老年人的“第三殺手”疾病。目前,我國已成為全球PD患者人數(shù)最多的國家,無論是從家庭的角度還是社會的角度,PD已經(jīng)成為影響市民生活質量、家庭健康和社會經(jīng)濟迅速發(fā)展的重大社會性問題。PD最主要的病理學特征是中腦黑質致密帶(substantia nigra pars compacta,SNc)多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元選擇性丟失,紋狀體(striatum,Str)內代謝產(chǎn)生的DA含量減少,導致PD的一系列相關癥狀,尤其是運動癥狀,如靜止性震顫、肌僵直、運動不能及姿勢反射障礙。很多病理學機制都被證明與PD的發(fā)病相關,如:氧化應激、炎癥反應、線粒體功能障礙、鐵沉積毒性、蛋白異常聚集和細胞凋亡等。諸多的病理學機制使得PD的防治極其復雜,且現(xiàn)行治療PD的藥物副作用不可忽略,因此尋求新的有效治療的靶點具有重要的意義。近年來有研究表明鉀離子通道功能異常與PD的發(fā)病密切相關,PD因而也被稱為“離子通道病”。Kv7/KCNQ/M通道(亦稱KCNQ通道)是電壓依賴型鉀離子通道,在基底神經(jīng)節(jié)廣泛分布,其中免疫組化染色顯示KCNQ4亞型在SNc表達豐富。本室的前期研究首次在SNc區(qū)DA能神經(jīng)元中記錄到KCNQ電流,并證實利用KCNQ通道特異性阻斷劑10,10二(4-吡啶甲基)-9(10H)-蒽酮(10,10-bis(2-fluoro-4-pyridinylmethyl)-9(10H)-anthracenone,XE991)能夠顯著抑制KCNQ電流,增強DA能神經(jīng)元的興奮性,提高自發(fā)放電頻率和簇狀放電,從而增加Str內DA的釋放。然而,以上研究主要關注了正常生理情況下KCNQ通道的功能,并未闡明在PD發(fā)病過程中KCNQ通道的生物學效應。因此,本研究旨在探討KCNQ通道在PD的DA能神經(jīng)元損傷中的調制作用。本實驗通過制備6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)誘導的PD大鼠模型,利用免疫組織化學和免疫印跡技術,觀察XE991側腦室給藥后對6-OHDA誘導的黑質(substantia nigra,SN)中酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)陽性神經(jīng)元數(shù)量、TH蛋白表達和Str內TH陽性神經(jīng)纖維數(shù)量的影響;利用高效液相色譜電化學檢測(high performance liquid chromatography,HPLC)法觀察Str內DA及其代謝產(chǎn)物含量的變化;通過阿樸嗎啡(apomorphine,APO)誘導的旋轉行為、曠場實驗、平衡木實驗及握力實驗,檢測XE991對PD模型大鼠運動速度、平衡能力、運動協(xié)調能力和肌強直狀況方面的影響;進一步在側腦室同時給予KCNQ通道開放劑Retigabine,再次觀察相關指標的變化。結果如下:1.通過Western blots檢測,在正常大鼠SNc區(qū)域中,KCNQ通道第4亞基——KCNQ4表達豐富。2.在6-OHDA誘導的PD大鼠模型中,損毀側SN區(qū)TH蛋白表達水平減少為正常對照組的12.5%,與正常對照組相比,差異有極顯著性(P0.001)。側腦室分別連續(xù)注射XE991(1μmol/L、5μmol/L和10μmol/L)21天后,5μmol/L和10μmol/L XE991處理組可以拮抗6-OHDA造成的TH蛋白表達降低,與6-OHDA組相比,差異有顯著性(P0.05,P0.01)。3.在6-OHDA誘導的PD大鼠模型中,損毀側SN區(qū)TH免疫陽性細胞數(shù)量下降了83.3%,與正常對照組相比,差異有極顯著性(P0.001)。側腦室連續(xù)21天注射10μmol/L XE991后,TH免疫陽性細胞數(shù)量恢復至正常對照組的45.6%,與6-OHDA組比較,差異有極顯著性(P0.001)。4.在6-OHDA誘導的PD大鼠模型中,損毀側Str內DA及其代謝產(chǎn)物二羥基苯乙酸(dihydroxyphenylacetic acid,DOPAC)和高香草酸(homovanillic acid,HVA)的含量均降低,與正常對照組大鼠相比分別降低84.5%、53.2%和53.6%,差異有極顯著性(P0.001)。側腦室連續(xù)21天注射10μmol/L XE991后,Str內DA、DOPAC和HVA含量與6-OHDA組相比分別升高,差異有顯著性(PDA0.01,PDOPAC0.001,PHVA0.01)。5.6-OHDA處理組大鼠與正常對照組相比Str內TH神經(jīng)末梢數(shù)量明顯減少。側腦室連續(xù)21天注射10μmol/L XE991后,TH陽性神經(jīng)末梢數(shù)量明顯增加。6.XE991對PD大鼠運動障礙有明顯的改善作用。在APO誘導的PD大鼠旋轉行為中,6-OHDA組大鼠的旋轉圈數(shù)明顯高于正常對照組,差異有極顯著性(P0.001);10μmol/L XE991處理組與6-OHDA組大鼠相比,旋轉圈數(shù)明顯減少(P0.001)。在曠場實驗中,6-OHDA組大鼠在曠場中平均運動速度與正常對照組大鼠相比速度較慢,差異有顯著性(P0.05);側腦室給予XE991(10μmol/L)處理21天之后,平均運動速度與6-OHDA組大鼠相比較快,運動緩慢癥狀有明顯改善,差異有顯著性(P0.05)。在平衡木實驗中,6-OHDA組大鼠在平衡木上的評分與正常對照組大鼠相比較低,平衡能力與運動協(xié)調能力明顯下降,差異有顯著性(P0.001);XE991處理組大鼠平衡木上的評分與6-OHDA組大鼠相比較高,平衡能力與運動協(xié)調能力有明顯改善,差異有顯著性(P0.05)。在握力強度實驗中,6-OHDA組大鼠在鋼絲上懸掛時間與正常對照組大鼠相比有明顯的增加,肌強直情況嚴重,差異有顯著性(P0.01);與6-OHDA處理組相比,XE991處理組大鼠肌強直情況明顯改善(P0.05)。7.在6-OHDA誘導的PD大鼠模型中,損毀側SN區(qū)TH蛋白表達減少,Str內DA、DOPAC和HVA的含量降低,大鼠出現(xiàn)運動緩慢、肌強直癥狀及平衡能力、運動協(xié)調能力下降,XE991處理組大鼠上述指標明顯改善;側腦室同時注射KCNQ鉀通道開放劑Retigabine連續(xù)21天可以完全拮抗XE991的神經(jīng)保護作用。以上結果表明,XE991對6-OHDA誘導的PD模型大鼠SN區(qū)DA能神經(jīng)損傷具有保護作用,可以增加SN區(qū)TH蛋白水平的表達及TH免疫陽性細胞數(shù)目,提高Str區(qū)DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC和HVA的含量,從而改善SN-Str系統(tǒng)的功能,并有效緩解PD模型大鼠的運動障礙。進一步實驗結果表明XE991的上述保護作用是通過抑制KCNQ鉀通道來實現(xiàn)的,KCNQ通道特異性開放劑Retigabine可以將XE991的保護作用完全阻斷。本實驗結果為KCNQ鉀通道參與PD提供了新的理論依據(jù),并為PD的藥物防治提供新的策略。
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【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R742.5

【參考文獻】

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本文編號：2421617