【摘要】：背景與目的低鉀型周期性麻痹(Hypokalemic periodic paralysis, HypoPP)是一組伴隨血清鉀降低,反復(fù)短暫性發(fā)作肌無(wú)力的遺傳性骨骼肌肉疾病。這種發(fā)作性的低血鉀主要是由于K+從細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移所致,嚴(yán)重者可發(fā)生呼吸肌麻痹,或者血鉀減低所致的惡性心律失常而危及生命。通過(guò)對(duì)HypoPP的遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn),該疾病主要涉及的離子通道基因有CACNA1S, SCN4A和KCNE3。其中,以CACNA1S基因R528H突變最具有代表性。在主要的CACNA1S和SCN4A基因上發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)中,絕大部分在相應(yīng)離子通道的S4跨膜片段上,并且為精氨酸(Arg)被組氨酸(His)所替代。S4片段作為離子通道電壓感受器的關(guān)鍵部位,在異源細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)其多個(gè)錯(cuò)義突變可產(chǎn)生一種滲漏電流,可解釋在低鉀條件下異常的去極化表現(xiàn)。但是,該離子通道的突變引起血清鉀濃度降低的分子機(jī)制目前仍然不十分清楚。為了避免人體實(shí)驗(yàn)以及離體實(shí)驗(yàn)的限制,我們選擇代表性好,發(fā)病癥狀重的CaV1.1Arg528His (R528H)突變,應(yīng)用基因敲入技術(shù)構(gòu)建Cchlla3基因(與人類CACNA1S基因?qū)?yīng))R528H突變小鼠模型,并對(duì)其進(jìn)行鑒定和分析。該模型可以將整體動(dòng)物和分子水平相結(jié)合,為HypoPP的病理生理與分子機(jī)制等研究提供合適的研究基礎(chǔ)。 方法部分1基因敲入小鼠的構(gòu)建：第一,將線性化的Cchlla3-Knockin打靶載體電轉(zhuǎn)染到胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ES細(xì)胞)中,經(jīng)過(guò)含有G418和Ganciclovoir的培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng),篩選出陽(yáng)性ES細(xì)胞克隆并收集起來(lái)。第二,提取陽(yáng)性ES克隆的基因組DNA,并用事先設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定,對(duì)特異性PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序,并再次行序列比對(duì)進(jìn)一步鑒定同源重組是否成功。第三,將陽(yáng)性ES克隆顯微注射到囊胚期的小鼠胚胎中,獲得嵌合體小鼠。第四,通過(guò)雜交確定生殖系遺傳后,雜合子小鼠與攜帶FLP重組酶小鼠交配繁育獲得去neo雜合子小鼠。部分2基因敲入小鼠的鑒定及分析：將去neo雜合子小鼠交配得到純合子后代,并再次通過(guò)PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序方法在基因水平鑒定目的突變是否存在,對(duì)其進(jìn)行外觀、活動(dòng)狀態(tài)、生長(zhǎng)發(fā)育及繁育能力等方面的觀察及分析。 結(jié)果我們將Cch11a3-Knockin打靶載體轉(zhuǎn)染到ES細(xì)胞中,PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序證實(shí)9個(gè)ES細(xì)胞克隆發(fā)生正確的同源重組。通過(guò)囊胚注射獲得7只高嵌合率小鼠并用上述方法鑒定。將嵌合體小鼠交配繁育的雜合子小鼠和FLP小鼠交配獲得9只去neo雜合子小鼠。我們最終獲得15只去neo純合子小鼠,并行PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)純合子小鼠只顯示一條870bp的條帶,而野生型小鼠只顯示一條748bp的條帶,同時(shí)通過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)純合子小鼠攜帶G→A目的突變。通過(guò)對(duì)純合子小鼠的觀察分析,發(fā)現(xiàn)該小鼠在發(fā)育至性成熟階段,精神、飲食及活動(dòng)狀態(tài)良好,不同性別的純合子與野生型小鼠在4周、6周和8周齡的平均體重比較無(wú)顯著性差異(P0.05)。但是,純合子小鼠在4個(gè)月齡時(shí)逐漸出現(xiàn)脫毛,皮膚破潰甚至死亡,且繁育能力低下。 結(jié)論成功構(gòu)建Cch11a3基因R528H突變的純合子小鼠,為研究人類CACNAlS基因功能和闡明低鉀型周期性麻痹發(fā)生的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。盡管純合子小鼠出現(xiàn)皮毛變化及生殖能力下降的現(xiàn)象,考慮可能與殘留的外源性基因有關(guān),也不排除環(huán)境因素的影響,還有待進(jìn)一步研究解釋。但是,該純合子小鼠在基因水平被證實(shí)攜帶目的突變,且能夠正常生長(zhǎng)至成年,仍具有生殖傳代能力,也能說(shuō)明該敲入小鼠的構(gòu)建是成功的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R746.3

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本文編號(hào)：2420921