【摘要】：第一部分：研究背景腦血管病是威脅全世界人類生命健康的一類疾病,它是繼腫瘤之后,在世界上引起人類死亡疾病病因中位居第二位。目前我國每年新發(fā)病例約150-180萬,死亡將近100萬,是我國城市死因的主要原因。據(jù)全國第三次死因回顧抽樣調(diào)查報(bào)告顯示,腦血管病已上升為我國人口死亡原因之首。在腦血管病中,缺血性腦血管病最為常見,其發(fā)生率約占全部腦卒中的70%-80%。顱內(nèi)血管狹窄是造成缺血性腦血管病的一個(gè)重要原因,其中又以大腦中動(dòng)脈狹窄或閉塞發(fā)生率最高,占顱內(nèi)動(dòng)脈病變的66%-73.3%。研究發(fā)現(xiàn)患有大腦中動(dòng)脈閉塞性疾病(middle cerebral artery occlusive diseases, MCAOD)每年同側(cè)腦缺血事件再發(fā)的幾率約為9.1%,而中國人有著更高的腦血管事件再發(fā)幾率。從分子水平研究大腦中動(dòng)脈閉塞的發(fā)生發(fā)展,對(duì)于該疾病的預(yù)防、控制和治療具有重要意義�；蛐酒夹g(shù)是21世紀(jì)生命科學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)重要的技術(shù)平臺(tái),能夠有效地篩選差異表達(dá)相關(guān)基因,具有快速測(cè)量和高通量等優(yōu)點(diǎn)。鑒于表達(dá)譜芯片技術(shù)在研究細(xì)胞基因表達(dá)模式上的優(yōu)勢(shì),基因表達(dá)譜芯片技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于疾病的發(fā)生機(jī)制、早期診斷、指導(dǎo)治療以及評(píng)估預(yù)后等相關(guān)的研究領(lǐng)域。隨著表達(dá)譜芯片技術(shù)的不斷發(fā)展,產(chǎn)生了海量的復(fù)雜的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)。然而如何解讀芯片上成千上萬的基因點(diǎn)的雜交信息,揭示其中蘊(yùn)含的生命特征和規(guī)律,己成為制約基因芯片技術(shù)應(yīng)用和發(fā)展的主要問題。生物信息學(xué)是一門交叉學(xué)科。它整合了包括信息學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)等多種技術(shù)手段來分析海量的生物數(shù)據(jù)所包含的信息從而揭示這些生物數(shù)據(jù)所賦有的生物學(xué)奧秘。它以生物芯片研究為基礎(chǔ),先對(duì)生物芯片的海量數(shù)據(jù)進(jìn)行初步篩選,再運(yùn)用序列比對(duì)、統(tǒng)計(jì)分析、生物聚類、通路分析、可視化作圖、以及啟動(dòng)子預(yù)測(cè)等方式,進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘,從而對(duì)疾病從分子水平進(jìn)行分析,闡述對(duì)疾病進(jìn)展的認(rèn)識(shí)。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展,已經(jīng)形成了新的生物學(xué)研究模式,即利用現(xiàn)有的數(shù)據(jù)信息,先進(jìn)行理論推測(cè),再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究以GEO數(shù)據(jù)庫為研究基礎(chǔ),以兩組小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞相關(guān)的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)為分析材料,旨在通過篩選大腦中動(dòng)脈閉塞的差異表達(dá)的基因,聯(lián)合生物信息軟件和方法對(duì)這些差異表達(dá)基因之間相互作用關(guān)系及富集功能進(jìn)行分析,從而探索與大腦中動(dòng)脈閉塞相關(guān)的基因、通路、轉(zhuǎn)錄因子、miRNA等,為更好地理解大腦中動(dòng)脈閉塞的發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制提供重要的信息,也為大腦中動(dòng)脈閉塞的分子診斷和個(gè)體化治療奠定基礎(chǔ)。第二部分：大腦中動(dòng)脈閉塞差異表達(dá)基因的篩選與生物信息學(xué)分析目的：大腦中動(dòng)脈閉塞發(fā)生的生物學(xué)過程十分復(fù)雜性,因此從基因組水平篩選與大腦中動(dòng)脈閉塞發(fā)生相關(guān)的功能基因成為該疾病研究的重要途徑。本章中利用基因芯片GSE35338對(duì)大腦中動(dòng)脈閉塞引起的缺血性中風(fēng)的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選,并對(duì)這些差異基因進(jìn)行功能注釋、通路分析及蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析,為探索大腦中動(dòng)脈閉塞發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。方法：從GEO公共數(shù)據(jù)庫下載編號(hào)為GSE35338基因芯片數(shù)據(jù)(物種：小鼠)。該數(shù)據(jù)集包含21個(gè)樣本,分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組為大腦中動(dòng)脈閉塞引起的缺血性中風(fēng)處理組,芯片檢測(cè)時(shí)間分別為處理后1天、3天和7天,除了第一天重復(fù)樣本為5個(gè),其他時(shí)間點(diǎn)都有3個(gè)重復(fù)樣本,對(duì)照組為假實(shí)驗(yàn)組,對(duì)照組第一天重復(fù)樣本數(shù)目為4,其他均為3個(gè)重復(fù)。對(duì)下載的芯片原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理后,篩選差異表達(dá)基因,篩選差異基因的標(biāo)準(zhǔn)為|logFC|1.5和p-value0.05。應(yīng)用DAVID在線工具分析不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的差異基因的GO功能和KEGG通路富集分析,并篩選富集顯著的GO條目和KEGG通路。之后分析3個(gè)不同觀察時(shí)間的差異表達(dá)的基因的重疊情況并繪制相應(yīng)的韋恩圖。在韋恩圖上挖掘在3個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)上都差異表達(dá)的基因,并做基因的功能富集分析。隨后,利用STRING在線工具據(jù)篩選差異表達(dá)基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)互作關(guān)系對(duì),并利用Cytoscape構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)。最后利用MCODE插件構(gòu)建子網(wǎng)絡(luò)模塊并對(duì)子網(wǎng)絡(luò)模塊的功能進(jìn)行分析。結(jié)果：研究發(fā)現(xiàn)在處理后1天,3天和7天組分別篩選到294,87和57個(gè)差異表達(dá)基因。下調(diào)基因沒有明顯富集的GO條目及代謝通路。第1天篩選到的上調(diào)的基因主要功能體現(xiàn)對(duì)傷口的處理、免疫的反應(yīng)、以及細(xì)胞的凋亡等過程；第3天的上調(diào)基因主要功能體現(xiàn)在細(xì)胞外區(qū)域等功能；第7天篩選到的上調(diào)基因主要富集的功能為免疫反應(yīng),炎癥反應(yīng)等。從韋恩圖中發(fā)現(xiàn)32個(gè)差異表達(dá)基因在3個(gè)觀察點(diǎn)出現(xiàn)差異表達(dá)的重疊情況,合并去重復(fù)差異表達(dá)基因后,共篩選出337個(gè)差異表達(dá)基因。在構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中,共篩選到22個(gè)聯(lián)通度大于10的節(jié)點(diǎn),其中Cxcl10和116連通度大于20。MCODE插件共挖聚到5個(gè)顯著性子網(wǎng)絡(luò),主要參與了細(xì)胞周期,免疫應(yīng)答,損傷應(yīng)答以及細(xì)胞增殖等功能。結(jié)論：(1)對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋與通路分析,為該疾病的實(shí)驗(yàn)室研究提供了理論基礎(chǔ)。(2)成功構(gòu)建了差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),其中Cxcl10和Il6可能參與大腦中動(dòng)脈閉塞的發(fā)展過程,并為該疾病的診斷和治療提供了新的研究方向。第三部分：PACAP38對(duì)大腦中動(dòng)脈閉塞影響的分子機(jī)制研究目的：缺血后的3小時(shí)為再灌注的“最佳時(shí)間”,能夠在6小時(shí)或稍長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)給予腦缺血病人有效及時(shí)的治療,對(duì)于疾病的預(yù)后至關(guān)重要。本章中利用基因芯片GSE62884分析了藥物垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽38(PACAP38)處理大腦中動(dòng)脈閉塞樣本引發(fā)的基因表達(dá)水平變化,并對(duì)這些差異基因進(jìn)行功能注釋、通路分析及蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析,為我們系統(tǒng)理解PACAP38對(duì)大腦動(dòng)脈閉塞影響的可能分子機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。方法：從GEO公共數(shù)據(jù)庫下載編號(hào)為GSE62884基因芯片數(shù)據(jù)(物種：小鼠)。GSE62884為雙通道芯片,包含8個(gè)樣本。實(shí)驗(yàn)組為PACAP38處理缺血核心區(qū)6小時(shí)和24小時(shí),對(duì)照組為鹽水處理缺血核心區(qū)6小時(shí)和24小時(shí)；另一組實(shí)驗(yàn)組為PACAP38處理半影區(qū)6小時(shí)和24小時(shí),對(duì)照組為鹽水處理半影區(qū)6小時(shí)和24小時(shí)。對(duì)下載的芯片原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理后,篩選差異表達(dá)基因,篩選差異基因的標(biāo)準(zhǔn)為|logFC|0.58和p-value0.05。應(yīng)用DAVID在線工具對(duì)各組的差異基因進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。隨后,利用STRING在線工具據(jù)篩選差異表達(dá)基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)互作關(guān)系對(duì),并利用Cytoscape構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)。然后利用ClusterONE構(gòu)建子網(wǎng)絡(luò)模塊并對(duì)子網(wǎng)絡(luò)模塊的功能進(jìn)行分析。對(duì)各組差異表達(dá)基因進(jìn)行文氏圖分析,并對(duì)交集基因構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)并挖掘網(wǎng)絡(luò)的子模塊。隨后,使用Cytoscape的iRegulon插件預(yù)測(cè)分析調(diào)控這些靶基因的轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)果：缺血核心區(qū)6小時(shí)組篩選出123個(gè)差異表達(dá)基因,缺血核心區(qū)24小時(shí)組篩選出2009個(gè)差異表達(dá)基因,半影區(qū)6小時(shí)組篩選出126個(gè)差異表達(dá)基因,半影區(qū)24小時(shí)組篩選出1484個(gè)差異表達(dá)基因。缺血核心區(qū)處理組的差異表達(dá)基因主要富集到了趨化因子活性,免疫應(yīng)答等相關(guān)的功能,半影區(qū)處理組的差異表達(dá)基因主要富集到了細(xì)胞增殖,免疫應(yīng)答和細(xì)胞外區(qū)域等功能條目。缺血核心區(qū)處理6小時(shí)的差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)包括16個(gè)節(jié)點(diǎn)和14個(gè)互作關(guān)系對(duì)。核心區(qū)處理24小時(shí)的差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)包括961個(gè)節(jié)點(diǎn)和4633個(gè)互作關(guān)系對(duì),并得到了4個(gè)顯著的子網(wǎng)絡(luò)模塊。半影區(qū)處理6小時(shí)的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)有33個(gè)節(jié)點(diǎn)和30個(gè)互作關(guān)系。24小時(shí)的蛋白質(zhì)互作有681個(gè)節(jié)點(diǎn),2873個(gè)互作關(guān)系對(duì),并得到3個(gè)顯著的子網(wǎng)絡(luò)模塊。文氏圖分析發(fā)現(xiàn)有1039個(gè)交集基因,構(gòu)建蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)Cxcl10和Il1b在2個(gè)組織2個(gè)時(shí)間點(diǎn)均上調(diào)表達(dá)。預(yù)測(cè)到的轉(zhuǎn)錄因子中Irfl、Bcl3、Nfkb1、Relb、Hic1、Ets1、編碼基因存在于1039個(gè)交集差異表達(dá)基因中。結(jié)論：(1)對(duì)在PACAP38處理缺血核心區(qū)和半影區(qū)中均差異表達(dá)的交集基因進(jìn)行功能注釋與通路分析,為該疾病的實(shí)驗(yàn)室研究提供了理論基礎(chǔ)。(2)構(gòu)建的交集基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中,Cxcl10和Il1b在2個(gè)組織2個(gè)時(shí)間點(diǎn)均上調(diào)表達(dá),可能在PACAP38治療該疾病中發(fā)揮重要作用。第四部分基因芯片GSE35338和GSE62884整合分析目的：我們對(duì)兩個(gè)基因芯片分析獲得的基因取交集,并對(duì)交集基因進(jìn)行功能富集分析,蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析,以及轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)分析,從而進(jìn)一步找出可能對(duì)大腦中動(dòng)脈閉塞的發(fā)生和發(fā)展起關(guān)鍵作用的基因或通路。方法：基因芯片GSE35338共得到337個(gè)基因,基因芯片GSE62884得到1039個(gè)基因。我們對(duì)這兩個(gè)基因芯片分析得到的337個(gè)基因和1039個(gè)基因取交集。應(yīng)用DAVID在線工具對(duì)交集基因進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析,并使用Cytoscape的插件Enrichmentmap建立關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。隨后利用GeneMANIA分析了交集基因之間的功能作用關(guān)系并建立功能作用網(wǎng)絡(luò)。并對(duì)交集基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)以及miRNA預(yù)測(cè)。結(jié)果：基因芯片GSE35338的337個(gè)基因,與芯片GSE62884的1039個(gè)基因取交集,共得到103個(gè)交集基因。這些基因顯著富集到了損傷應(yīng)答,炎癥反應(yīng),免疫應(yīng)答,以及細(xì)胞增殖等功能和通路。富集條目經(jīng)過Enrichmentmap分析后發(fā)現(xiàn)GO:0009611-RESPONSE TO WOUNDING, GO:0006954-INFLAMMATORY RESPONSE, MMU04620:TOLL-LIKE RECEPTOR SIGNALING PATHWAY, GO:0005576-EXTRACELLULAR REGION等與其它條目關(guān)聯(lián)數(shù)目最高。結(jié)合GeneMANIA分析得到的基因功能作用網(wǎng)絡(luò)包括97個(gè)節(jié)點(diǎn)和1996個(gè)功能作用關(guān)系。預(yù)測(cè)得到的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中包括有75個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,其中,Bc13、Irf1、Maff、 Fosll、Stat6和Stat3有著很高的連接度。miRNA-靶基因關(guān)系對(duì)分析共獲得2635個(gè)miRNA-靶基因關(guān)系對(duì),包含668個(gè)miRNA,例如miR-124,miR-29c等。結(jié)論：(1)交集基因功能注釋與通路分析發(fā)現(xiàn),這些基因顯著富集到了損傷應(yīng)答,炎癥反應(yīng),免疫應(yīng)答等功能條目。(2)成功構(gòu)建了功能條目關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò),基因功能作用網(wǎng)絡(luò),轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò),并成功預(yù)測(cè)了miRNA-靶基因關(guān)系對(duì),這些轉(zhuǎn)錄因子和miRNA可能在大腦中動(dòng)脈閉塞的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,可能為該相關(guān)疾病治療的重要分子靶標(biāo)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R743

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 孫國柱;劉寶江;馬波濤;朱小輝;趙宗茂;;Toll樣受體4在腦血管病中的表達(dá)及其作用[J];中華老年心腦血管病雜志;2014年01期

2 高蕊;甘尚權(quán);;腦缺血再灌注損傷后小分子RNA的分析[J];山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2011年10期

3 高法梁;婁遠(yuǎn)蕾;阮瓊芳;涂偉;呂世剛;潘長(zhǎng)福;吳雷;汪泱;鄧志鋒;;缺血性腦損傷大鼠MicroRNA 210的動(dòng)態(tài)變化[J];實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué);2010年03期

4 孫l，

本文編號(hào)：2412899