發(fā)布時(shí)間：2019-01-20 14:37

【摘要】：第一部分ICR新生乳鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的培養(yǎng)鑒定及細(xì)胞癲癇模型的建立目的:分離、培養(yǎng)和鑒定新生ICR乳鼠皮層神經(jīng)元,優(yōu)化匹魯卡品和ROCK抑制劑Y-27632的濃度,建立匹魯卡品誘導(dǎo)的神經(jīng)元癲癇模型。方法:1.采用木瓜蛋白酶消化法分離ICR新生小乳鼠皮層神經(jīng)元,培養(yǎng)至第8天時(shí)用微管相關(guān)蛋白MAP2抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定神經(jīng)元;2.將培養(yǎng)8天的神經(jīng)元分為對(duì)照組和癲癇模型組:對(duì)照組給予正常神經(jīng)元培養(yǎng)基培養(yǎng),癲癇模型組在神經(jīng)元培養(yǎng)基中分別加入終濃度為1、2、3和4mmol·L-1匹魯卡品,24h后換為正常培養(yǎng)基;3.分別于造模后1、3和7天對(duì)各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行細(xì)胞生長形態(tài)記錄、F-actin熒光染色實(shí)驗(yàn);4.匹魯卡品+抑制劑組神經(jīng)元培養(yǎng)基中加入終濃度為3mmol·L-1匹魯卡品,24h后分別換為含有5,10和15μmol·L-1 Y-27632的培養(yǎng)液,24h后換為正常培養(yǎng)基。5.全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄癲癇模型組和抑制劑組神經(jīng)元的動(dòng)作電位。結(jié)果:1.成功分離并培養(yǎng)新生ICR乳鼠皮層神經(jīng)元,培養(yǎng)15天后神經(jīng)元胞體飽滿,突起密集,結(jié)構(gòu)清晰并交織成密集網(wǎng)絡(luò);2.免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示:MAP2陽性染色為棕黃色,神經(jīng)元純度達(dá)90%;3.F-actin染色結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,2mmol·L-1匹魯卡品組熒光強(qiáng)度和細(xì)胞形態(tài)無明顯變化;造模后1天,3mmol·L-1和4mmol·L-1匹魯卡品組F-actin的熒光強(qiáng)度明顯減弱,細(xì)胞突起變短消失,細(xì)胞間網(wǎng)絡(luò)連接瓦解;在造模后3天和7天,3mmol·L-1匹魯卡品組神經(jīng)元突起和細(xì)胞間網(wǎng)絡(luò)逐漸恢復(fù),神經(jīng)元狀態(tài)改善,熒光強(qiáng)度增強(qiáng);4mmol·L-1匹魯卡品組F-actin熒光強(qiáng)度微弱,神經(jīng)元結(jié)構(gòu)基本崩解,細(xì)胞大量死亡。4.倒置相差顯微鏡形態(tài)觀察結(jié)果顯示:匹魯卡品+抑制劑(5μM)組的神經(jīng)元形態(tài)恢復(fù)良好,胞體逐漸飽滿立體,神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重新建立;匹魯卡品+抑制劑(10μM)組和匹魯卡品+抑制劑(15μM)組在第7天時(shí),細(xì)胞大量死亡,幾乎無正常神經(jīng)元。5.全細(xì)胞膜片鉗動(dòng)作電位檢測(cè)結(jié)果顯示:正常培養(yǎng)8天的神經(jīng)元僅有偶爾或單個(gè)的自發(fā)性放電,放電頻率低;3mmol·L-1匹魯卡品神經(jīng)元興奮性明顯增加,放電頻率變高,呈現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)自發(fā)的反復(fù)癲癇樣放電,且放電幅度更高;5μmol·L-1Y-27632抑制匹魯卡品誘發(fā)的癲癇樣放電,神經(jīng)元興奮性下降,放電頻率和幅度均有所降低。結(jié)論:利用3mmol·L-1匹魯卡品誘導(dǎo)神經(jīng)元癲癇樣放電,成功建立細(xì)胞癲癇模型;拮抗3mmol·L-1匹魯卡品的ROCK抑制劑Y-27632適宜濃度為5μmol·L-1。第二部分匹魯卡品誘導(dǎo)的癲癇神經(jīng)元中樹突棘密度及樹突棘素表達(dá)水平的改變目的:探討在匹魯卡品誘導(dǎo)細(xì)胞癲癇模型中以及ROCK2抑制劑Y-37632處理細(xì)胞模型后,神經(jīng)元樹突形態(tài)、樹突棘密度及樹突棘素表達(dá)水平的變化。方法:1.培養(yǎng)8天的神經(jīng)元分為對(duì)照組、癲癇模型組和抑制劑組:對(duì)照組給予正常神經(jīng)元培養(yǎng)基;癲癇模型組的神經(jīng)元培養(yǎng)基中加入終濃度為3mmol·L-1匹魯卡品,作用24h后換為正常培養(yǎng)基;抑制劑組在神經(jīng)元培養(yǎng)基中加入終濃度為3mmol·L-1匹魯卡品,作用24h后分別換為含有5μmol·L-1 Y-27632的培養(yǎng)液,24h后換為正常培養(yǎng)基;2.分別于抑制劑Y-27632作用后的1、3和7天對(duì)各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行細(xì)胞生長形態(tài)記錄、F-actin熒光染色實(shí)驗(yàn)、單位長度樹突棘數(shù)量統(tǒng)計(jì)、樹突棘素的免疫細(xì)胞化學(xué)染色、Western blot免疫印跡實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:1.F-actin熒光染色結(jié)果和單位長度樹突棘數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:樹突棘位于神經(jīng)元樹突上,呈較小的突起狀。與對(duì)照組相比,1d和3d的癲癇模型組神經(jīng)元樹突棘明顯減少,熒光強(qiáng)度減弱;而抑制劑組神經(jīng)元樹突上出現(xiàn)大量新生樹突棘前體,樹突棘密度雖然低于對(duì)照組,但明顯高于癲癇組,且數(shù)量逐漸增多,與培養(yǎng)時(shí)間呈正相關(guān)性。到7d時(shí),兩組樹突棘數(shù)量均基本恢復(fù)到對(duì)照組水平(n=30,*P0.05 vs Con,**P0.01 vs Con;#P0.05 vs Pilo,##P0.01 vs Pilo)。2.免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示:,對(duì)照組1d時(shí)樹突棘素(Spinophilin)表達(dá)主要分布于核周胞質(zhì)中;隨著培養(yǎng)時(shí)間延長,其表達(dá)逐漸升高,第7d時(shí),Spinophilin陽性染色變深,主要分布于樹突內(nèi)。癲癇模型組胞質(zhì)內(nèi)樹突棘素陽性染色強(qiáng)于對(duì)照組,而樹突棘中spinophilin則弱于對(duì)照組;抑制劑組的陽性表達(dá)較對(duì)照組和癲癇組均加強(qiáng),廣泛分布于胞質(zhì)和樹突內(nèi)。3.免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,癲癇模型組的Spinophilin蛋白水平明顯降低,雖然隨著時(shí)間的增加逐漸有所恢復(fù),但仍低于對(duì)照組表達(dá)水平,兩組相較具有顯著性差異;與癲癇模型組相比,抑制劑組的Spinophilin蛋白表達(dá)水平明顯升高,差異顯著(n=3,*P0.05 vs Con,**P0.01 vs Con;#P0.05 vs Pilo,##P0.01 vs Pilo)。結(jié)論:在匹魯卡品誘導(dǎo)的癲癇神經(jīng)元中F-actin解聚導(dǎo)致樹突棘密度減少,而ROCK2抑制劑Y-27632能緩解這種現(xiàn)象,提示Rho/ROCK2信號(hào)在匹魯卡品誘導(dǎo)的癲癇神經(jīng)元中被激活引起神經(jīng)元損傷,而Y-27632則發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。第三部分匹魯卡品誘導(dǎo)的癲癇神經(jīng)元中Calponin 3、ROCK2及pho-ROCK2蛋白分布及表達(dá)改變目的:通過觀察并分析匹魯卡品及ROCK2抑制劑Y-27632對(duì)神經(jīng)元中Calponin 3、ROCK2及磷酸化ROCK2(pho-ROCK2)在細(xì)胞內(nèi)分布及蛋白表達(dá)水平的變化,探討樹突棘重建、F-actin重排與Rho/ROCK2信號(hào)通路和Calponin 3的關(guān)系。方法:1.培養(yǎng)8天的神經(jīng)元分為對(duì)照組、癲癇模型組和抑制劑組:對(duì)照組為正常培養(yǎng)基;癲癇模型組在神經(jīng)元培養(yǎng)基中加入終濃度為3mmol·L-1匹魯卡品,作用24h后換為正常培養(yǎng)基;抑制劑組在神經(jīng)元培養(yǎng)基中加入終濃度為3mmol·L-1匹魯卡品,作用24h后換為含有5μmol·L-1 Y-27632的培養(yǎng)液,24h后換為正常培養(yǎng)基;2.分別于抑制劑Y-27632作用后的1、3和7天對(duì)各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)、Western blot免疫印跡實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:1.免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示:對(duì)照組中ROCK2和Calponin 3彌散分布于胞質(zhì)和突起中,陽性染色淺,細(xì)胞輪廓不清晰;癲癇模型組中ROCK2和Calponin 3陽性染色深,大量聚集在細(xì)胞膜及細(xì)胞皮質(zhì),表達(dá)水平隨時(shí)間延長逐漸升高,輪廓變得清晰銳利,可見樹突串珠樣病變;抑制劑組中ROCK2陽性染色較癲癇組變淺,局部輪廓模糊,串珠樣病變變小;Calponin 3陽性染色在7d時(shí)明顯變淺。2.免疫印跡實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,1d、3d和7d時(shí)癲癇模型組ROCK2和pho-ROCK2蛋白水平均顯著升高,其蛋白水平與隨培養(yǎng)時(shí)間延長呈升高趨勢(shì);1d和3d時(shí),抑制劑組ROCK2蛋白總體表達(dá)水平雖高于對(duì)照組,7d則低于對(duì)照組,1d時(shí),抑制劑組pho-ROCK2蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組,但隨著培養(yǎng)時(shí)間延長,pho-ROCK2高表達(dá)逐漸降低,到第7d時(shí),已經(jīng)顯著低于對(duì)照組;同時(shí),抑制劑組ROCK2蛋白水平則一直顯著低于癲癇組。與對(duì)照組相比,1d和3d時(shí)癲癇模型組與抑制劑組中Calponin 3蛋白水平顯著升高;3d時(shí),抑制劑組Calponin 3表達(dá)達(dá)到峰值,而后降低并接近對(duì)照水平;癲癇模型組在第7d時(shí)Calponin 3表達(dá)才達(dá)到峰值。結(jié)論:匹魯卡品誘導(dǎo)癲癇發(fā)作后,Rho/ROCK2信號(hào)被激活,神經(jīng)元內(nèi)啟動(dòng)自我修復(fù)的負(fù)反饋機(jī)制。F-actin結(jié)合蛋白Calponin3表達(dá)量增加,還可能被pho-ROCK2催化而發(fā)生磷酸化,識(shí)別和結(jié)合F-acitn,促進(jìn)F-acitn結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和重排,促進(jìn)突起和樹突棘生長,修復(fù)受損傷神經(jīng)元。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R742.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 賈麗潔;羅艷;張富軍;于布為;;Drebrin對(duì)突觸可塑性的影響以及相關(guān)認(rèn)知功能障礙的研究進(jìn)展[J];中國藥理學(xué)通報(bào);2010年08期

2 宋慧娟;蘇玉虹;;CFL2基因研究進(jìn)展[J];中國農(nóng)學(xué)通報(bào);2006年02期

，

本文編號(hào)：2412117