【摘要】：腦膠質瘤作為顱內最常見的惡性腫瘤,目前臨床上根據(jù)WHO分級標準對膠質瘤進行治療及預后評估。膠質瘤是一種高度惡性、呈浸潤性生長的腫瘤,與周圍正常腦組織往往分界不清,并易于復發(fā),故臨床療效不理想,相當多的膠質瘤患者在積極治療后的24個月內死亡。當前國內外對膠質瘤一致的治療方案是在兼顧患者生命安全和盡可能保留神經(jīng)功能的前提下最大范圍的切除病灶,同時聯(lián)合替莫唑胺等藥物化療及或放療。近年來,對膠質瘤患者進行手術治療、放療以及化療等治療方法均取得了較大的進步,確實有很多膠質瘤患者通過手術治療聯(lián)合放化療提高了生活質量并延長了生存期。但高級別膠質瘤患者的總體預后并沒有得到明顯改善。研究表明,膠質瘤的惡性程度會隨著生長時期的延長而遞增,復發(fā)膠質瘤的惡性程度也會增加。因此,腦膠質瘤是神經(jīng)外科領域中最復雜、最難根治的疾病之一。目前隨著對膠質瘤分子免疫學和病因學的研究,涌現(xiàn)出越來越多針對膠質瘤治療的免疫學和基因學的新的治療手段。CD164作為唾液黏蛋白家族成員之一,包含唾液酸成分。它作為花生凝集素結合位點載體被首次發(fā)現(xiàn),在多種惡性腫瘤中,CD164被發(fā)現(xiàn)作為一種與腫瘤相關的碳水化合物分子標記。研究表明CD164可調節(jié)造血干細胞及祖細胞增殖、黏附及轉移。也有報道表明CD164可通過促進人CD34+細胞黏附至骨髓基質中從而調控機體造血功能。近年研究表明CD164除了能調控正常細胞生長和分化,還可以調控惡性腫瘤細胞生長和侵襲。CD164已經(jīng)被證實與諸如成神經(jīng)管細胞瘤、宮頸癌和結腸癌等多種惡性腫瘤密切相關。一項早期研究表明CD164可能參與調控前列腺癌骨轉移；還有研究表明CD164被認為在監(jiān)測急性成淋巴細胞性白血病和過敏癥中充當了分子標記的作用。以上研究均表明CD164在調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起了關鍵作用。目前CD164與人腦膠質瘤的相關性研究尚未見報道。前期研究中我們將人膠質瘤系U87細胞進行干細胞培養(yǎng)后,與普通U87細胞株進行全基因組測序分析,同時對3位膠質母細胞瘤患者的腫瘤組織以及周邊正常腦組織之間同樣進行全基因測序分析。我們將兩組分析結果的差異基因進行比對,并采用qPCR技術進行驗證后發(fā)現(xiàn),膠質瘤相對正常腦組織,腫瘤干細胞相對普通U87細胞中CD164呈明顯高表達。鑒于此,在本研究中我們將探討CD164在膠質瘤組織及細胞系中的表達、與膠質瘤生長和凋亡的關系及其機制的研究。本研究總體分為四部分：1.CD164在人腦膠質瘤中的表達和臨床病理學特征的關系目的：探討CD164在人腦膠質瘤組織及膠質瘤細胞系中的表達,分析CD164與膠質瘤臨床病理特征的關系,并進一步探討CD164在膠質瘤中的臨床意義。方法：收集溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科在2013年6月至2015年6月期間收治的50例腦膠質瘤患者的臨床標本,所有標本均經(jīng)過經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師確診為膠質瘤。其中包括24例男性和26例女性患者,年齡在46-73歲之間,平均年齡63±5歲,另外設立10例腦外傷患者行內減壓后取的新鮮腦組織作為對照(已通過醫(yī)院倫理委員會審查及備案)。我們將本次實驗隊列中的50例患者標本依照2007年WHO對中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的分級標準分為Ⅰ級6例、Ⅱ級8例、Ⅲ級15例和Ⅳ級21例。所有納入本次實驗隊列的膠質瘤患者均為首次接受膠質瘤手術,術前均未接受放化療治療。其他排除標準包括急慢性感染、吞咽困難、充血性心力衰竭、COPD和肝硬化、機體其它部位腫瘤等。采用RT-PCR方法檢測人腦膠質瘤組織中CD164的表達情況；RT-PCR及Western blot法檢測人膠質瘤細胞系U251、SHG-44和U87以及人正常星形膠質細胞系NHA中CD164的表達。結果：所有標本經(jīng)HE染色證實均為膠質瘤。對50例膠質瘤標本進行RT-PCR檢測結果表明：與非瘤腦組織標本相比,CD164在膠質瘤樣本組織中mRNA水平明顯升高(t=-18.128,P0.001),差異有統(tǒng)計學顯著性；RT-PCR檢測結果表明CD164 mRNA在人膠質瘤細胞系U251、SHG-44和U87中的表達含量明顯高于人正常星形膠質細胞系NHA中的表達,而western blot檢測結果表明CD164在膠質瘤細胞系中的表達較NHA顯著升高,鑒于U87細胞中的CD164表達高于U251和SHG-44細胞系,U87被選擇進一步研究CD164在膠質瘤細胞中的作用。結論：CD164 mRNA在人腦膠質瘤組織中的表達明顯升高,同時CD164蛋白在多種膠質瘤細胞系中的表達顯著升高。2.CD164慢病毒表達載體的構建及其對人膠質瘤U87細胞增殖和凋亡的影響目的：通過構建靶向干擾CD164表達的人腦膠質瘤細胞系U87的慢病毒載體,觀察沉默CD164表達后對U87細胞增殖、凋亡及凋亡相關蛋白表達的影響。方法：通過慢病毒感染的方式將CD164基因的短發(fā)夾狀RNA (shRNA)感染至人腦膠質瘤U87細胞,從而獲得穩(wěn)定沉默CD164基因的U87細胞；通過RT-PCR及western blot檢測感染CD164 shRNA后對CD 164 mRNA及蛋白表達的影響；CCK-8法檢測細胞增殖；流式細胞術檢測細胞凋亡；Western blot檢測感染慢病毒后對U87細胞凋亡相關蛋白caspase 3、Bax及Bc12表達的影響。結果：1.感染CD164 shRNA后U87細胞中CD164 mRNA和蛋白表達量較感染前明顯降低。CD164 mRNA在U87/shCD164組細胞和U87/shNC組細胞中的相對表達量分別為0.35±0.04和1.06±0.14,兩組相比較有統(tǒng)計學顯著性(P0.001); Western blot檢測結果表明,CD164蛋白在U87/shCD164組細胞和U87/shNC組細胞中的相對表達量分別為0.57±0.07和1.64±0.21,兩組之間相比較有顯著性差異(P0.001)。2.細胞生物學功能性實驗結果表明：與陰性對照組相比較,感染shCD164至U87細胞后,U87細胞生長明顯被抑制,同時細胞凋亡顯著增加,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.感染shCD164后對U87細胞凋亡相關蛋白表達的影響：蛋白質印跡結果表明感染shCD164至U87細胞后可上調cleaved-caspase 3和Bax在U87細胞中的表達,并下調Bc12在細胞中的表達。結論：成功構建高效能沉默CD164基因的shRNA表達載體,該載體感染至人膠質瘤U87細胞系后可顯著抑制U87細胞增殖,并誘導細胞凋亡,同時調控凋亡相關蛋白caspse3、Bax和Bc12在U87細胞中的表達。3.慢病毒RNA干擾C1D164對人膠質瘤裸鼠皮下瘤生長和凋亡的影響目的：將慢病毒介導的U87-shCD164細胞注射入裸鼠皮下,觀察慢病毒介導的CD164基因沉默效果,同時觀察其對膠質荷瘤裸鼠增殖和凋亡的影響。方法：1.運用隨機數(shù)字表法將30只SPF級雌性BALB/C裸鼠分為三組,將已建立的穩(wěn)定沉默CD164的U87-shCD164細胞,陰性對照組U87-shNC細胞和空白對照組U87細胞分別經(jīng)皮下注射至裸鼠膠質瘤皮下移植瘤模型中。觀察荷瘤裸鼠的進食、活動、精神狀況和睡眠等情況,定期測量皮下移植瘤的體積,移植術后第56天處死裸鼠,完整切除腫瘤組織并稱重,計算抑瘤率；2.運用免疫組化檢測Ki-67在各組腫瘤組織中的表達,RT-PCR檢測CD164在各組皮下移植瘤中的表達；3.TUNEL法檢測移植瘤細胞凋亡指數(shù)(apoptotic index, AI)。結果：1.從皮下注射腫瘤細胞的第10天開始,U87-shCD164組裸鼠皮下移植瘤的生長速度明顯滯后于陰性對照組和空白對照組；實驗結束后,U87-shCD164組裸鼠皮下移植瘤重量為(0.78±0.23)g,明顯低于空白對照組[(1.81±0.37)g]和陰性對照組[(1.73±0.35)g],差異有統(tǒng)計學意義(P0.001)。2.免疫組化結果表明,與空白對照組或陰性對照組相比較,U87-shCD164組皮下移植瘤組織中Ki-67陽性表達明顯下調：同時U87-shCD164組腫瘤組織中CD164mRNA表達水平顯著下降。3. TUNEL實驗結果表明,U87-shCD164組裸鼠皮下移植瘤AI為(21.5±4.2)%,與空白對照組[(5.6±1.4)%]和陰性對照組[(6.7±1.8)%]相比較,有顯著性差異(P0.001)�？瞻讓φ战M與陰性對照組相比較,差異無統(tǒng)計學意義。結論：1.慢病毒介導的shRNA靶向沉默U87細胞中CD164的表達可抑制裸鼠膠質瘤皮下移植瘤生長,從而通過體內實驗證實沉默CD164治療膠質瘤的有效性。2.沉默CD164基因抑制體內膠質瘤生長的作用機制可能與促進膠質瘤細胞凋亡相關。3.通過體內實驗表明靶向CD164的基因治療是一種比較安全有效的治療手段,從而為膠質瘤新型基因靶向藥物治療的研發(fā)提供了有效的實驗參考。4.沉默CD164在U87細胞中的表達抑制膠質瘤細胞生長及誘導細胞凋亡的機制探討目的：探討PTEN/PI3K/AKT生存通路在慢病毒介導的shCD164對體內外U87細胞生長和凋亡中的作用。方法：1.Western blot檢測感染慢病毒后對U87細胞中PTEN、p-AKT和p53蛋白表達的影響；2.RT-PCR檢測感染慢病毒后對U87細胞中PTEN mRNA表達的影響；3.Western blot檢測PTEN和p53在各組裸鼠皮下移植瘤中的表達。結果：1.Western blot結果表明沉默U87細胞中的CD164表達可上調PTEN和p53蛋白的表達,同時抑制p-AKT磷酸化的表達;2.CD164 shRNA可明顯上調PTEN mRNA在體外U87細胞中的表達；3.體外實驗結果表明,與空白對照組或陰性對照組相比較,U87-shCD164組裸鼠皮下移植瘤組織中的PTEN和p53蛋白的表達明顯增加。結論：體內外實驗結果表明PTEN/PI3K/AKT通路在CD164抑制體內外膠質瘤生長和誘導細胞凋亡過程中發(fā)揮了一定作用。綜上所述,本研究結果表明：CD164基因與腦膠質瘤關系密切,從而在膠質瘤的診斷和治療方面具有一定的積極意義。應用慢病毒介導的shRNA靶向沉默CD164在膠質瘤細胞中的表達可有效抑制體內外膠質瘤細胞的生長,并誘導細胞凋亡,該作用可能通過PTEN/P13K/AKT通路來調節(jié)凋亡相關因子的表達,進而促進膠質瘤細胞的凋亡。本研究工作可能為膠質瘤的治療及預后評估提供了新的治療靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41

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本文編號：2404141