【摘要】：帕金森病(Parkinson disease)是發(fā)病人數(shù)僅次于阿爾茨海默綜合癥(Alzheimer disease,AD)的世界上第二大神經(jīng)退行性疾病。大部分帕金森病病人在發(fā)病中晚期才會(huì)出現(xiàn)明顯地行為學(xué)表現(xiàn),對(duì)于早期的帕金森病病人缺少有效的預(yù)防和診斷方法。目前關(guān)于帕金森病的研究已經(jīng)取得了許多進(jìn)展,發(fā)現(xiàn)了許多和帕金森病相關(guān)的基因包括α-synuclein,PARK2(parkin)和PARK6(PINK1)等。帕金森病在早期的分子生物學(xué)特點(diǎn)和表現(xiàn)對(duì)于帕金森病的診斷和致病機(jī)制的研究十分重要。疾病動(dòng)物模型包括化學(xué)誘導(dǎo)模型和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型對(duì)于人類疾病的研究發(fā)揮著十分重要的作用,相對(duì)于化學(xué)誘導(dǎo)模型,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型可以幫助研究者對(duì)疾病的整個(gè)發(fā)病過(guò)程進(jìn)行全程研究,尤其是對(duì)于一些病人發(fā)病早期沒有明顯表現(xiàn)臨床上不易診斷出來(lái)的疾病例如之前提到的帕金森病和阿爾茨海默病等。因此,對(duì)于帕金森病,構(gòu)建疾病動(dòng)物模型,特別是基于基因工程技術(shù)的轉(zhuǎn)基因疾病動(dòng)物模型對(duì)于帕金森病的研究具有十分重要的意義。實(shí)驗(yàn)室基于帕金森病相關(guān)基因的研究和分析,借助實(shí)驗(yàn)室的輔助生殖技術(shù)平臺(tái),利用基因工程技術(shù)的手段構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型和基因修飾動(dòng)物模型。借助慢病毒載體技術(shù),構(gòu)建慢病毒載體建立了 α-synuclein過(guò)表達(dá)的的獼猴動(dòng)物模型,后來(lái)利用CRISPR/cas9技術(shù)構(gòu)建了 PARK2和PARK6的基因敲除的食蟹猴動(dòng)物模型。借助實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的帕金森病動(dòng)物模型(A53T獼猴和CRISPR/cas9修飾的食蟹猴)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和small RNA測(cè)序技術(shù),通過(guò)分析動(dòng)物血液中的基因差異性表達(dá)和small RNA的異常表達(dá)情況探究帕金森病的早期發(fā)病特點(diǎn)和機(jī)制。同時(shí)借助二代測(cè)序技術(shù)對(duì)CRISPR/cas9的sgRNA的效率進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間存在明顯的基因表達(dá)差異,主要的蛋白編碼基因主要涉及血紅蛋白氧傳遞,核糖體亞基,線粒體和主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)等。對(duì)轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)進(jìn)行WGCNA分析,結(jié)果顯示差異表達(dá)基因的功能涉及膜,識(shí)別和抗原傳遞等方面。另外,對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行血液生化指標(biāo)分析,對(duì)于帕金森病的早期研究也是十分重要的,血液生化分析顯示有多個(gè)指標(biāo)實(shí)驗(yàn)組的值和對(duì)照組的值有明顯差異,提示帕金森病可能在早期存在免疫功能異常的表現(xiàn),部分指標(biāo)已經(jīng)在研究中被發(fā)現(xiàn)和帕金森病病人的發(fā)病情況有關(guān)。因此,也再一次證明實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的動(dòng)物模型可以幫助和應(yīng)用于帕金森病的研究。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析結(jié)果來(lái)看實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間存在著免疫功能方面的差異表現(xiàn),這對(duì)于認(rèn)識(shí)和研究帕金森病的早期發(fā)病特點(diǎn)十分重要。提示對(duì)于帕金森病發(fā)病早期的研究可能可以從免疫功能異常方面入手在分子生物學(xué)水平探究其發(fā)病特點(diǎn)和機(jī)制為帕金森病的早期診斷提供了新的研究方向和思路。對(duì)于small RNA的分析結(jié)果,發(fā)現(xiàn)miR-144-3P和miR-144-5P的一些情況在部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物身上具有顯著性的差異表達(dá),miR-144-的功能主要和腫瘤相關(guān),根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的實(shí)際情況排除這一影響,預(yù)測(cè)miR-144的靶向調(diào)控基因包括:PINK1,PARK2和α-synuclein等,這些基因都是和帕金森病相關(guān)的基因。另外最新研究發(fā)現(xiàn),在已經(jīng)確診的帕金森病病人的尸體上檢測(cè)到異常表達(dá)的miR-144,其中文章中預(yù)測(cè)的靶基因包括在實(shí)驗(yàn)室分析預(yù)測(cè)到的靶基因中。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行PCA分析,發(fā)現(xiàn)可以將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組按照miR-144的表達(dá)情況進(jìn)行區(qū)分。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物的構(gòu)建使用的是嵌合體技術(shù),以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡仍然比較小等原因,所以實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物尚未表現(xiàn)出典型的帕金森的行為學(xué)表現(xiàn)。.這些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提供了一個(gè)機(jī)會(huì)幫助我們切入帕金森病的早期研究,因此在未來(lái)可以對(duì)這些動(dòng)物進(jìn)行必要的分子生物學(xué)檢測(cè),并且利用醫(yī)學(xué)影像觀察手段對(duì)動(dòng)物進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè),可能在分子生物學(xué)水平上捕捉到一些較為顯著的分子生物學(xué)特征和表現(xiàn),來(lái)幫助未來(lái)對(duì)帕金森病的早期診斷和發(fā)現(xiàn)。通過(guò)使用對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析的方法對(duì)嵌合體胚胎sgRNA的基因修飾效率進(jìn)行分析為下一步構(gòu)建轉(zhuǎn)基因非人靈長(zhǎng)類疾病動(dòng)物模型提供了重要的參考依據(jù)。使用疾病動(dòng)物模型結(jié)合現(xiàn)在的測(cè)序技術(shù)和生物信息分析手段,對(duì)于探究人類疾病的早期發(fā)病特點(diǎn)和機(jī)制具有重要的指導(dǎo)意義。結(jié)合實(shí)驗(yàn)和研究中免疫功能異常和帕金森病之間的關(guān)聯(lián)性,可以更好的模擬帕金森病的實(shí)際情況。這些新的設(shè)計(jì)思路可以幫助完善這些動(dòng)物模型的構(gòu)建和使用,更好的模擬帕金森病病人真實(shí)的發(fā)病過(guò)程,對(duì)于帕金森病和阿爾茨海默病這些復(fù)雜人類疾病的研究和認(rèn)識(shí)具有重要的指導(dǎo)意義和參考意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R742.5;R-332

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本文編號(hào)：2389136