【摘要】：背景 帕金森�。≒arkinson's disease, PD）是目前發(fā)病率僅次于阿茲海默病的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，其病理特點是中腦黑質致密部多巴胺能神經元的死亡以及路易氏體形成。然而對于帕金森病的發(fā)病機制目前仍然不清楚，目前的研究認為其與年齡因素、遺傳因素和神經毒物等因素有關。我國目前大概有180多萬人患有這種疾病，并且伴隨著我國社會老齡化，估計在未來25年帕金森病的發(fā)病率將會翻倍。因此，帕金森病已經成為神經系統(tǒng)疾病領域亟需解決的重大難題。 黑質致密部多巴胺能(SNc DA)神經元是基底神經節(jié)的重要的組成部分。另外，在近期的研究中，有學者發(fā)現中腦黑質致密部多巴胺能神經元易于受損，而與其相鄰的腹側被蓋區(qū)多巴胺能神經元所受的影響相對較小。并且有學者發(fā)現使用特異性L型鈣通道拮抗劑可以對抗環(huán)境毒物引起的黑質致密部多巴胺能神經元缺失。因此，我們可以推測離子通道的分布與神經元放電模式的變化在帕金森病的發(fā)生發(fā)展過程中，發(fā)揮著重要作用。國內外已有文獻報道鈣離子通道參與帕金森病發(fā)病過程，主要可能與鈣超載誘發(fā)的線粒體功能障礙有關，但其具體機制目前尚未完全闡明。 黑質致密部多巴胺能神經元有著特殊的生理特點，大多數的多巴胺能神經元有著自發(fā)的放電，放電規(guī)整，呈“鐘擺樣”，頻率為2-4Hz。其細胞膜上分布著大量在較低電位激活的鈣離子通道，在生理條件下，對細胞內線粒體產生基礎水平的代謝壓力。但是在神經毒物誘發(fā)的氧化應激條件下，多巴胺能神經元的膜屬性及放電模式的變化目前還沒有明確的機制研究。 腦片培養(yǎng)技術是一個研究神經系統(tǒng)退行性疾病的良好平臺，具有很多優(yōu)勢。培養(yǎng)的腦組織片保留了完整的細胞結構和局部的功能突觸聯系環(huán)路，具有良好狀態(tài)的神經功能活動。并且腦片培養(yǎng)的實驗有著易于控制處理條件和便于觀察的優(yōu)勢，為使用制作帕金森病的體外環(huán)境模擬提供了很好的平臺。 目的 本課題旨在研究6-羥基多巴胺（6-OHDA）對黑質多巴胺能神經元電生理屬性的調節(jié)作用。在6-OHDA引起的氧化應激條件下，觀察研究SNc DA神經元興奮性和放電模式的變化，并將它們與電壓依賴性鈣離子通道和小電導鈣激活的鉀離子通道聯系起來。進一步在腦片培養(yǎng)模型中分析在放電模式轉變中SK通道的作用及機制；以及將電生理方法和細胞生物學方法結合，探究小電導鈣激活的鉀離子通道（SK通道）在6-OHDA誘導的神經元死亡中的保護作用，為帕金森病的預防和治療提供新思路和策略。 方法 在實驗中，我們使用急性分離腦片和腦片培養(yǎng)兩種模型來研究神經毒物6-OHDA對SNc DA神經元的作用。在短期和較長時間6-OHDA處理情況下，利用全細胞膜片鉗技術觀察黑質致密部多巴胺能神經元細胞興奮性，神經元放電模式及動作電位速率變化。進一步的，我們觀察了6-OHDA對電壓依賴性鈣離子通道與小電導鈣激活的鉀離子通道的作用。本課題分為兩個部分： 首先，在大鼠急性分離的腦片使用膜片鉗全細胞記錄,觀察急性6-OHDA（0.5mM）作用對黑質致密部多巴胺能神經元放電模式和放電頻率的變化，主要是對峰峰間期柱狀圖和放電頻率變異系數進行了分析。在電壓鉗模式下，測量了電壓依賴性鈣通道電流，，并使用特異性鈣離子拮抗劑分離了各亞型鈣離子通道電流。比較了6-OHDA組和對照組中SNc DA神經元的鈣離子通道亞型電流的比例。使用短暫的去極化電壓誘導出后超極化電流。 其次，使用腦片培養(yǎng)技術建立了一個可以使用低劑量6-OHDA（25μM）長時間處理多巴胺神經元的腦片模型。利用乳酸脫氫酶（LDH）釋放試驗評估腦片培養(yǎng)神經元的活力；利用絡氨酸羥化酶(TH)免疫組化標記多巴胺能神經元，觀察神經元的形態(tài)學特點；結合膜片鉗全細胞記錄技術，通過自相關分析，探索SK通道在6-OHDA引起的放電模式變化中所發(fā)揮的作用；同時，使用TUNEL法檢測黑質區(qū)神經元的損傷情況。 結果 1.6-OHDA對大鼠黑質致密部多巴胺能神經元電生理特性的影響 1.16-OHDA（0.5mM）對多巴胺能神經元的放電頻率有明顯抑制作用，且具有劑量依賴性。6-OHDA組的峰峰間期的變異率（CV=0.435±0.354）與對照組（CV=0.058±0.009）相比，明顯變大（P=0.037）。 1.2通過空間時域圖（phase plot）分析，發(fā)現6-OHDA減慢了DA能神經元去極化過程中的速率。 1.3在6-OHDA（0.5mM）暴露下，電壓依賴性鈣通道電流增大，且N型鈣離子通道電流比例較control組增大（P=0.0404）。 1.46-OHDA（0.5mM）對mAHP的影響與SK通道激動劑1-EBIO的效應類似的，即mAHP的峰值電流與對照組相比增大至177.53±4.96pA(149.12±4.11%，P0.01) 2.在中腦黑質腦片培養(yǎng)模型中，SK通道參與6-OHDA誘導的神經元凋亡 2.1中腦腦片培養(yǎng)模型多巴胺能神經元的形態(tài)學和電生理特點與急性分離的多巴胺能神經元類似，表明腦片模型培養(yǎng)成功，且通過LDH釋放試驗表明腦片組織的代謝水平穩(wěn)定。 2.218h6-OHDA（25μM）處理組的神經元靜息膜電位較對照組明顯升高（p=0.023）。 2.36-OHDA（25μM）的處理降低了神經元峰電位的軌道周徑，減慢了神經元動作電位的去極化和復極化的速率。 2.4在6-OHDA（25μM）暴露下，SK通道抑制劑Apamin可以誘發(fā)更頻繁的爆發(fā)性放電，而SK通道的激動劑可以減少爆發(fā)性放電。 2.56-OHDA（25μM）可以增大Apamin敏感性SK電流67.13±8.45%（P 0.01），但當在細胞內液加入EGTA（3mM或5mM）螯合胞內鈣離子時，ImAHP明顯減小，且具有劑量依賴性。 2.6SK通道激動劑1-EBIO可以對抗6-OHDA（25μM）誘導的神經元凋亡，而Apamin會增加6-OHDA誘導的神經元凋亡。 結論 規(guī)律的節(jié)律放電（pacemaking）是黑質致密部多巴胺神經元的特征性表現，本實驗發(fā)現6-OHDA可以改變多巴胺能神經元的放電模式，由規(guī)律的pacemaking模式變?yōu)榛祀s著爆發(fā)性放電的不規(guī)則放電模式。這種改變的主要原因之一是由于6-OHDA改變了電壓依賴性鈣離子通道和SK通道電流的大小。同時，在6-OHDA暴露下，使用SK通道激動劑可以對抗其誘導的神經元凋亡，證明了SK通道活性在氧化應激條件下發(fā)揮著重要作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R742.5

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本文編號：2381269