【摘要】：帕金森病(Parkinson's disease, PD)是以黑質多巴胺能神經元變性缺失和神經元內路易小體形成為特征的中老年常見神經系統(tǒng)變性疾病,臨床表現(xiàn)包括運動遲緩、靜止性震顫、肌強直和姿勢步態(tài)障礙等。隨著人口老齡化進程的加劇,PD已成為嚴重影響老年人群生活質量的社會問題。目前針對PD的治療主要以改善癥狀為主,不能阻止或逆轉該病的進展。越來越多的研究認為,內質網應激是PD發(fā)病機制中的重要環(huán)節(jié),且內質網應激可能在PD病變的早期可能起到更為重要的作用,持續(xù)的內質網應激可導致細胞凋亡。通過干預內質網應激或為PD新的治療策略。 腦內存在相對獨立的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin-system, RAS),在中腦多巴胺能神經元中可見血管緊張素Ⅱ (Ang Ⅱ AT1受體和AT2受體表達。研究發(fā)現(xiàn),Ang Ⅱ與PD多巴胺能神經元損傷存在密切關系。Ang Ⅱ能夠通過AT1受體加劇多巴胺能神經元死亡,Ang Ⅱ AT1受體阻斷劑(ARB)能夠阻斷6-OHDA或MPTP的多巴胺能神經元的毒性作用。但是具體機制尚不清楚。魚藤酮具有脂溶性,不僅能夠特異性損傷多巴胺能神經元,而且在神經元內有α-共核蛋白沉積,因此,魚藤酮模型更接近PD病理改變。 基本區(qū)域亮氨酸拉鏈(bZIP)轉錄因子家族成員的活化轉錄因子4(ATF4)是內質網應激的主要效應因子之一。研究發(fā)現(xiàn),PD患者中腦組織ATF4上游主要激活因子磷酸化eIF2a表達增高。ATF4在PD發(fā)病機制中的作用尚不清楚,ATF4調控細胞存活是由控制下游因子決定。一方面,ATF4能夠誘導轉錄因子CHOP表達增加,進而激活Puma,導致細胞凋亡,ATF4-CHOP-Puma被認為是內質網應激導致神經元凋亡的重要信號通路。另一方面,ATF4亦可調節(jié)泛素E3連接酶parkin的表達,而parkin的功能失調能夠導致神經細胞死亡。因此,調節(jié)ATF4的表達,對于控制神經細胞的存活至關重要。 本研究第一部分工作,采用對毒物刺激反應較穩(wěn)定的Lewis大鼠,利用微量滲透泵緩慢注入魚藤酮制備PD大鼠模型,同時予坎地沙坦酯治療,觀察坎地沙坦酯對PD大鼠運動功能、中腦黑質多巴胺能神經元數(shù)量及α-共核蛋白沉積的影響。同時,我們研究坎地沙坦酯對大鼠中腦內質網應激的變化,觀察坎地沙坦酯對ATF4-CHOP-Puma通路的影響,探索坎地沙坦酯對魚藤酮誘導多巴胺能神經元保護機制。 為了進一步分析ATF4在神經元凋亡中的作用,我們采用了能夠特異性抑制p-eIF2α去磷酸化的藥物salubrinal。觀察salubrinal對魚藤酮誘導SH-SY5Y細胞的作用,并探討ATF4調控下游信號因子在調節(jié)細胞存活的機制。 第一部分坎地沙坦酯對魚藤酮誘導PD大鼠多巴胺能神經元的保護作用及機制研究 目的：研究坎地沙坦強酯對魚藤酮誘導PD大鼠多巴胺能神經元損傷的保護作用及機制 方法：10周齡Lewis雄性大鼠隨機分為對照組、魚藤酮組、魚藤酮+坎地沙坦酯組及坎地沙坦酯組。魚藤酮(2.5-3.0mg/kg·d)溶于等體積二甲亞砜(DMSO)和聚乙二醇(PEG-300)溶劑中,將充填有魚藤酮的微泵埋置入實驗動物背部皮下。對照組及坎地沙坦酯組給予等質量的生理鹽水,裝于微量滲透泵中。坎地沙坦酯混于0.5%甲基纖維素中進行灌胃(1mg/kg·d).4周后,分別評估大鼠體重、血壓和行為學變化。免疫組織化學染色觀察中腦黑質TH陽性細胞變化和α-共核蛋白表達情況；Western blotting檢測上述腦區(qū)酪氨酸羥化酶表達、內質網應激相關蛋白(GRP78、ATF4、CHOP、Puma)及cleaved caspase-3的表達情況。RT-PCR檢測內質網應激相關基因的表達情況。 結果：(1)相對于魚藤酮組,坎地沙坦酯能夠抑制魚藤酮所致體重減輕,改善動物運動癥狀。小劑量的坎地沙坦酯對各組大鼠血壓無明顯影響。(2)與魚藤酮組相比,坎地沙坦酯能減少大鼠中腦黑質TH細胞死亡；同時,坎地沙坦酯能夠逆轉上述腦區(qū)TH表達的下調；坎地沙坦酯治療組大鼠中腦黑質洳共核蛋白表達亦明顯減少。(3)魚藤酮損傷大鼠模型中腦黑質區(qū)存在內質網應激,GRP78、ATF4、CHOP、Puma蛋白和基因均表達增加；坎地沙坦酯能夠有效抑制上述蛋白和基因的增加。另外,Western blotting分析發(fā)現(xiàn)坎地沙坦酯減少cleaved caspase-3水平。 結論： 1、坎地沙坦酯能夠改善魚藤酮誘導大鼠行為學和病理學損傷,發(fā)揮神經保護作用。 2、坎地沙坦酯神經保護作用的機制涉及抑制ATF4-CHOP-Puma信號通路,減少內質網應激導致的細胞凋亡。 第二部分Salubrinal在魚藤酮誘導的SH-SY5Y細胞損傷中的作用及機制研究 目的：研究salubrinal在魚藤酮誘導SH-SY5Y細胞損傷中的作用及機制。 方法：培養(yǎng)SH-SY5Y細胞,給予魚藤酮(100nM)建立損傷模型,研究salubrinal對魚藤酮誘導的SH-SY5Y細胞損傷作用的調節(jié)。MTT法檢測魚藤酮和salubrinal對SH-SY5Y細胞活力的影響。流式細胞儀檢測魚藤酮和salubrinal對SH-SY5Y細胞凋亡；Western blotting檢測蛋白內質網應激相關蛋白表達；采用siRNA干擾ATF4、parkin表達,分析ATF4-parkin通路在調節(jié)細胞凋亡中的作用。結果：(1)魚藤酮作用時間6h, Western blotti(?)g分析發(fā)現(xiàn)GRP78、CHOP表達明顯增高,cleaved caspase-3表達亦顯著增加,說明內質網應激參與魚藤酮誘導SH-SY5Y細胞凋亡。(2)魚藤酮作用時間611、12h時,流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)salubrinal能有效減少細胞凋亡；同時, western blotting分析顯示cleaved caspase-3表達降低。(3)通過siRNA抑制ATF4表達后,salubrinal對細胞的保護作用減弱,同時下游蛋白CHOP parkin表達降低；敲除parkin后,salubrinal對細胞的保護作用亦減弱。另外,salubrinal作用12h后,介導CHOP核內轉移的LIP表達降低。 結論： 1%Salubrinal能夠減輕魚藤酮誘導的SH-SY5Y細胞損傷。 2、ATF4-parkin通路是保護DA能神經元、治療PD的重要靶點,Salubrinal可通過上調ATF、parkin水平可以有效減少魚藤酮所致的細胞凋亡。本研究為PD的對因治療提供新的策略。 綜上所述,本文的主要創(chuàng)新之處在于： 1、坎地沙坦醣對魚藤酮致PD大鼠具有保護作用坎地沙坦酯能夠改善運動功能,減少中腦黑質多巴胺能神經元的凋亡,降低黑質區(qū)α-共核蛋白的表達,魚藤酮誘導PD大鼠中腦黑質區(qū)存在內質網應激并導致多巴胺能神經元缺失,而坎地沙坦酯能夠通過ATF4-CHOP-Puma通過減少細胞凋亡 2、Salubrinal對魚藤酮誘導的SH-SY5Y細胞具有保護作用Salubrinal能夠減少魚藤酬導致的SH-SY5Y細胞凋亡,分子機制可能與salubrinal增加ATF4、parkin表達水平,減少CHOP的核內轉移有關。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R742.5

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本文編號：2362808