【摘要】：帕金森病(Parkinson's disease, PD)是以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性缺失和神經(jīng)元內(nèi)路易小體形成為特征的中老年常見神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,臨床表現(xiàn)包括運(yùn)動遲緩、靜止性震顫、肌強(qiáng)直和姿勢步態(tài)障礙等。隨著人口老齡化進(jìn)程的加劇,PD已成為嚴(yán)重影響老年人群生活質(zhì)量的社會問題。目前針對PD的治療主要以改善癥狀為主,不能阻止或逆轉(zhuǎn)該病的進(jìn)展。越來越多的研究認(rèn)為,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是PD發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié),且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能在PD病變的早期可能起到更為重要的作用,持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。通過干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激或為PD新的治療策略。 腦內(nèi)存在相對獨(dú)立的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin-system, RAS),在中腦多巴胺能神經(jīng)元中可見血管緊張素Ⅱ (Ang Ⅱ AT1受體和AT2受體表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),Ang Ⅱ與PD多巴胺能神經(jīng)元損傷存在密切關(guān)系。Ang Ⅱ能夠通過AT1受體加劇多巴胺能神經(jīng)元死亡,Ang Ⅱ AT1受體阻斷劑(ARB)能夠阻斷6-OHDA或MPTP的多巴胺能神經(jīng)元的毒性作用。但是具體機(jī)制尚不清楚。魚藤酮具有脂溶性,不僅能夠特異性損傷多巴胺能神經(jīng)元,而且在神經(jīng)元內(nèi)有α-共核蛋白沉積,因此,魚藤酮模型更接近PD病理改變。 基本區(qū)域亮氨酸拉鏈(bZIP)轉(zhuǎn)錄因子家族成員的活化轉(zhuǎn)錄因子4(ATF4)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的主要效應(yīng)因子之一。研究發(fā)現(xiàn),PD患者中腦組織ATF4上游主要激活因子磷酸化eIF2a表達(dá)增高。ATF4在PD發(fā)病機(jī)制中的作用尚不清楚,ATF4調(diào)控細(xì)胞存活是由控制下游因子決定。一方面,ATF4能夠誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子CHOP表達(dá)增加,進(jìn)而激活Puma,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,ATF4-CHOP-Puma被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡的重要信號通路。另一方面,ATF4亦可調(diào)節(jié)泛素E3連接酶parkin的表達(dá),而parkin的功能失調(diào)能夠?qū)е律窠?jīng)細(xì)胞死亡。因此,調(diào)節(jié)ATF4的表達(dá),對于控制神經(jīng)細(xì)胞的存活至關(guān)重要。 本研究第一部分工作,采用對毒物刺激反應(yīng)較穩(wěn)定的Lewis大鼠,利用微量滲透泵緩慢注入魚藤酮制備PD大鼠模型,同時予坎地沙坦酯治療,觀察坎地沙坦酯對PD大鼠運(yùn)動功能、中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量及α-共核蛋白沉積的影響。同時,我們研究坎地沙坦酯對大鼠中腦內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的變化,觀察坎地沙坦酯對ATF4-CHOP-Puma通路的影響,探索坎地沙坦酯對魚藤酮誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元保護(hù)機(jī)制。 為了進(jìn)一步分析ATF4在神經(jīng)元凋亡中的作用,我們采用了能夠特異性抑制p-eIF2α去磷酸化的藥物salubrinal。觀察salubrinal對魚藤酮誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的作用,并探討ATF4調(diào)控下游信號因子在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活的機(jī)制。 第一部分坎地沙坦酯對魚藤酮誘導(dǎo)PD大鼠多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用及機(jī)制研究 目的：研究坎地沙坦強(qiáng)酯對魚藤酮誘導(dǎo)PD大鼠多巴胺能神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及機(jī)制 方法：10周齡Lewis雄性大鼠隨機(jī)分為對照組、魚藤酮組、魚藤酮+坎地沙坦酯組及坎地沙坦酯組。魚藤酮(2.5-3.0mg/kg·d)溶于等體積二甲亞砜(DMSO)和聚乙二醇(PEG-300)溶劑中,將充填有魚藤酮的微泵埋置入實驗動物背部皮下。對照組及坎地沙坦酯組給予等質(zhì)量的生理鹽水,裝于微量滲透泵中。坎地沙坦酯混于0.5%甲基纖維素中進(jìn)行灌胃(1mg/kg·d).4周后,分別評估大鼠體重、血壓和行為學(xué)變化。免疫組織化學(xué)染色觀察中腦黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞變化和α-共核蛋白表達(dá)情況；Western blotting檢測上述腦區(qū)酪氨酸羥化酶表達(dá)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(GRP78、ATF4、CHOP、Puma)及cleaved caspase-3的表達(dá)情況。RT-PCR檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)情況。 結(jié)果：(1)相對于魚藤酮組,坎地沙坦酯能夠抑制魚藤酮所致體重減輕,改善動物運(yùn)動癥狀。小劑量的坎地沙坦酯對各組大鼠血壓無明顯影響。(2)與魚藤酮組相比,坎地沙坦酯能減少大鼠中腦黑質(zhì)TH細(xì)胞死亡；同時,坎地沙坦酯能夠逆轉(zhuǎn)上述腦區(qū)TH表達(dá)的下調(diào)；坎地沙坦酯治療組大鼠中腦黑質(zhì)洳共核蛋白表達(dá)亦明顯減少。(3)魚藤酮損傷大鼠模型中腦黑質(zhì)區(qū)存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,GRP78、ATF4、CHOP、Puma蛋白和基因均表達(dá)增加；坎地沙坦酯能夠有效抑制上述蛋白和基因的增加。另外,Western blotting分析發(fā)現(xiàn)坎地沙坦酯減少cleaved caspase-3水平。 結(jié)論： 1、坎地沙坦酯能夠改善魚藤酮誘導(dǎo)大鼠行為學(xué)和病理學(xué)損傷,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。 2、坎地沙坦酯神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制涉及抑制ATF4-CHOP-Puma信號通路,減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。 第二部分Salubrinal在魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷中的作用及機(jī)制研究 目的：研究salubrinal在魚藤酮誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷中的作用及機(jī)制。 方法：培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞,給予魚藤酮(100nM)建立損傷模型,研究salubrinal對魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷作用的調(diào)節(jié)。MTT法檢測魚藤酮和salubrinal對SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響。流式細(xì)胞儀檢測魚藤酮和salubrinal對SH-SY5Y細(xì)胞凋亡；Western blotting檢測蛋白內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)；采用siRNA干擾ATF4、parkin表達(dá),分析ATF4-parkin通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中的作用。結(jié)果：(1)魚藤酮作用時間6h, Western blotti(?)g分析發(fā)現(xiàn)GRP78、CHOP表達(dá)明顯增高,cleaved caspase-3表達(dá)亦顯著增加,說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與魚藤酮誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。(2)魚藤酮作用時間611、12h時,流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)salubrinal能有效減少細(xì)胞凋亡；同時, western blotting分析顯示cleaved caspase-3表達(dá)降低。(3)通過siRNA抑制ATF4表達(dá)后,salubrinal對細(xì)胞的保護(hù)作用減弱,同時下游蛋白CHOP parkin表達(dá)降低；敲除parkin后,salubrinal對細(xì)胞的保護(hù)作用亦減弱。另外,salubrinal作用12h后,介導(dǎo)CHOP核內(nèi)轉(zhuǎn)移的LIP表達(dá)降低。 結(jié)論： 1%Salubrinal能夠減輕魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷。 2、ATF4-parkin通路是保護(hù)DA能神經(jīng)元、治療PD的重要靶點,Salubrinal可通過上調(diào)ATF、parkin水平可以有效減少魚藤酮所致的細(xì)胞凋亡。本研究為PD的對因治療提供新的策略。 綜上所述,本文的主要創(chuàng)新之處在于： 1、坎地沙坦醣對魚藤酮致PD大鼠具有保護(hù)作用坎地沙坦酯能夠改善運(yùn)動功能,減少中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的凋亡,降低黑質(zhì)區(qū)α-共核蛋白的表達(dá),魚藤酮誘導(dǎo)PD大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元缺失,而坎地沙坦酯能夠通過ATF4-CHOP-Puma通過減少細(xì)胞凋亡 2、Salubrinal對魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞具有保護(hù)作用Salubrinal能夠減少魚藤酬導(dǎo)致的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡,分子機(jī)制可能與salubrinal增加ATF4、parkin表達(dá)水平,減少CHOP的核內(nèi)轉(zhuǎn)移有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R742.5

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本文編號：2362808