發(fā)布時(shí)間：2018-11-26 07:29

【摘要】：目的：（1）探討CT-1(Cardiotrophin1)是否對(duì)hUCB-MSCs神經(jīng)分化具有促進(jìn)作用，尋找一種合適的細(xì)胞因子誘導(dǎo)hUCB-MSCs分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，可能為神經(jīng)系統(tǒng)疾病修復(fù)帶來(lái)希望；（2）研究MAPK/ERK信號(hào)分子在hUCB-MSCs神經(jīng)分化中的調(diào)控機(jī)制。 方法：（1）分離、培養(yǎng)及鑒定hUCB-MSCs：收集人臍帶血標(biāo)本，用改良密度梯度離心法結(jié)合貼壁法分離臍血中單個(gè)核細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)變化并繪制生長(zhǎng)曲線，用流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD29、CD44和CD105的表達(dá)。（2）病毒轉(zhuǎn)染：將Adv-CT-1及Adv-EGFP（腺病毒增強(qiáng)型綠色熒光蛋白）分別轉(zhuǎn)染hUCB-MSCs，于轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h和96h用免疫熒光染色檢測(cè)CT-1表達(dá)率，熒光顯微鏡下觀察CT-1和EGFP轉(zhuǎn)染成功率。（3）神經(jīng)標(biāo)志物及凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)：免疫熒光分別檢測(cè)對(duì)照組、EGFP組、CT-1組及NIM組Nestin、NeuN及MBP神經(jīng)標(biāo)志物表達(dá)；WesternBlot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染CT-1組及對(duì)照組調(diào)亡相關(guān)蛋白bcl2、Bax、Bak等表達(dá)情況。（4）免疫共沉淀法（CO-IP）及Western Blot法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)hUCB-MSCs的CT-1受體（gp130和LIFRβ）及信號(hào)分子p-Raf-1、ERK1/2和p-ERK1/2表達(dá)；加入MEK抑制劑后Western Blot法檢測(cè)Nestin、NeuN、MBP及p-ERK表達(dá)情況。 結(jié)果：（1）hUCB-MSCs培養(yǎng)及鑒定：原代細(xì)胞培養(yǎng)第5d可見多角形細(xì)胞和大量大而圓的破骨樣細(xì)胞及雜細(xì)胞，12d后可見大量梭形細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)，平均28d可以傳代。傳代后約12h后細(xì)胞逐漸貼壁，細(xì)胞呈均一的梭形細(xì)胞，3-5d可再次傳代，P3細(xì)胞得到形態(tài)均一，3-4d細(xì)胞融合率達(dá)90%。分離培養(yǎng)出hUCB-MSCs高表達(dá)間充質(zhì)相關(guān)抗原CD105（89.31%）、整合素家族CD29（98.41%）、細(xì)胞黏附分子CD44（99.20%）、不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志CD34。（2）腺病毒轉(zhuǎn)染：病毒轉(zhuǎn)染率隨著時(shí)間及MOI的改變而變化，病毒MOI為100PFU/細(xì)胞時(shí)，在轉(zhuǎn)染72h，轉(zhuǎn)染效率較高（87.60±1.36%）且細(xì)胞形態(tài)與生長(zhǎng)方式與未感染細(xì)胞相同，為最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)。（3）CT-1對(duì)hUCB-MSCs神經(jīng)誘導(dǎo)分化作用：誘導(dǎo)6h后CT-1組及NIM組即呈類神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)改變，CT-1組變化更明顯；4組中，CT-1組Nestin陽(yáng)性率最高（86.82±4.29%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；至第4d時(shí)，各組Nestin表達(dá)明顯減少，CT-1組仍高于其他組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；誘導(dǎo)后6h，CT-1組NeuN即有少量表達(dá)（14.26±2.20%），隨后逐漸升高，第4d時(shí)陽(yáng)性率達(dá)48.33±2.53%；CT-1組陽(yáng)性率均高于其他各組（P0.05）；誘導(dǎo)后6h，各組MBP均有少量表達(dá)，隨后表達(dá)率逐漸升高，至第4d時(shí)陽(yáng)性率最高，CT-1組6h（14.12±2.16%）及4d（45.63±2.78%）時(shí)MBP陽(yáng)性率均高于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；CT-1對(duì)bax、bak及caspase3等凋亡相關(guān)蛋白影響：Western Blot結(jié)果顯示CT-1組bcl-2表達(dá)較對(duì)照組增加，CT-1組凋亡相關(guān)蛋白bax、bak、caspase3及caspase9表達(dá)（0.01±0.00，0.09±0.01，0.30±0.01，0.32±0.02）低于對(duì)照組（0.16±0.01，1.14±0.02，0.58±0.01，0.72±0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。（4）不同時(shí)間點(diǎn)CT-1受體（gp130和LIFRβ）表達(dá)及ERK1/2、Raf-1磷酸化表達(dá)：轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，hUCB-MSCs可見p-Raf-1、p-ERK1/2及gp130微弱表達(dá)，未見LiFRβ表達(dá)；48h見LiFRβ微弱表達(dá)，p-Raf-1、p-ERK1/2及gp130表達(dá)增強(qiáng)，與24h相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；72h時(shí)，gp130/LiFRβ及ERK1/2表達(dá)未見進(jìn)一步增強(qiáng)；p-ERK1/2和p-Raf-1表達(dá)仍繼續(xù)增加，與48h相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。加入不同濃度PD98059后ERK磷酸化、MBP、NeuN及Nestin水平變化：10umol/L PD98059可使MBP、NeuN、Nestin及p-ERK表達(dá)減少（P0.05）；100umol/L PD98059可使MBP、NeuN、Nestin及p-ERK表達(dá)明顯減少，，與10umol//L組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。結(jié)論：（1）改良密度梯度結(jié)合貼壁培養(yǎng)法可以培養(yǎng)獲得hUCB-MSCs；（2）Adv-CT-1可以高效轉(zhuǎn)染hUCB-MSCs；（3）CT-1可以促進(jìn)hUCB-MSCs向神經(jīng)方向分化并抑制凋亡；（4）MAPK/ERK信號(hào)通路參與hUCB-MSCs神經(jīng)分化的調(diào)控。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R741

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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2 楊云華,廖維宏,伍亞民,張正豐,李紅運(yùn),劉媛,龍?jiān)谠?腺病毒介導(dǎo)的心肌營(yíng)養(yǎng)素-1基因轉(zhuǎn)染對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國(guó)脊柱脊髓雜志;2005年06期

3 李同歡;李振宏;杜淑珍;束曉梅;;Adv-CT1轉(zhuǎn)染對(duì)神經(jīng)元的作用[J];遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2010年05期

本文編號(hào)：2357794