【摘要】：第一部分Id2在缺血缺氧的神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá) 目的：觀察Id2（inhibitor of DNAbinding2）在缺血缺氧的神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)。 方法：構(gòu)建大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞缺血（middle cerebral artery occlusion, MCAO）/再灌注模型，采用免疫組化、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chainreaction, RT-qPCR）和蛋白印跡半定量法檢測大鼠腦缺血半暗帶皮層神經(jīng)細(xì)胞中Id2、Bax的表達(dá)情況，同時(shí)采用TUNEL染色法觀察大鼠腦缺血半暗帶皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況。然后采用CoCl2處理大鼠B35神經(jīng)細(xì)胞模擬低氧培養(yǎng)模型，通過RT-qPCR和蛋白印跡半定量法檢測缺氧B35神經(jīng)細(xì)胞中Id2、Bax的表達(dá)情況，，同時(shí)采用流式細(xì)胞儀檢測處于Sub-G1期的細(xì)胞數(shù)量，以反映神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。最后，采用三重免疫熒光染色分析在MACO/再灌注后24小時(shí)的缺血半暗帶皮質(zhì)神經(jīng)元中，Id2、TUNEL及NeuN的共定位情況。 結(jié)果：體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均表明在缺血缺氧后的神經(jīng)細(xì)胞中Id2mRNA，Id2蛋白和Bax蛋白的表達(dá)均有明顯增多（P均0.01），并且神經(jīng)細(xì)胞凋亡隨缺血缺氧時(shí)間的延長明顯增多（P0.01）。進(jìn)一步的三重免疫熒光染色分析顯示Id2、TUNEL及NeuN共定位于缺血半暗帶皮質(zhì)的神經(jīng)細(xì)胞中（P0.01）。 結(jié)論：缺血缺氧可明顯上調(diào)Id2在神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)，并且Id2的上調(diào)與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的增多是同步的。Id2可能在缺血缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要作用。 第二部分敲低或過表達(dá)Id2對缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 目的：探討Id2在缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用。 方法：構(gòu)建Id2-siRNA敲低序列和慢病毒介導(dǎo)的過表達(dá)載體（pGMLV）轉(zhuǎn)染/感染大鼠B35神經(jīng)細(xì)胞，采用CoCl2處理大鼠B35神經(jīng)細(xì)胞模擬低氧培養(yǎng)48小時(shí)，然后采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況。 結(jié)果： Id2被siRNA敲低后，大鼠B35神經(jīng)細(xì)胞在CoCl2低氧處理48小時(shí)后的凋亡率為（4.8±0.4）%，而對照組的凋亡率為（19.7±1.5）%，二者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。過表達(dá)Id2后，大鼠B35神經(jīng)細(xì)胞在CoCl2低氧處理48小時(shí)后的凋亡率為（39.5±3.5）%，而對照組大鼠的凋亡率為(19.3±1.6)%，二者之間的差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。 結(jié)論：Id2在缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要作用：敲低Id2可明顯減少缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡；而過表達(dá)Id2則可促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。 第三部分敲低Id2對腦缺血大鼠神經(jīng)損傷的影響及分子機(jī)制研究 目的：通過側(cè)腦室注射siRNA敲低腦缺血大鼠神經(jīng)細(xì)胞Id2的表達(dá)，觀察其對腦缺血大鼠神經(jīng)損傷的影響，并探討其可能的分子機(jī)制。 方法：首先在大鼠的側(cè)腦室注射Id2-siRNA，24小時(shí)后構(gòu)建大鼠MCAO/再灌注模型，采用RT-qPCR和蛋白印跡半定量法檢測腦缺血后24小時(shí)和72小時(shí)神經(jīng)細(xì)胞中Id2mRNA、Id2蛋白及Bax蛋白的表達(dá)情況；然后采用神經(jīng)功能缺陷量表評估大鼠在腦缺血24小時(shí)和72小時(shí)的神經(jīng)功能缺陷情況，并采用TTC染色法觀察大鼠在腦缺血72小時(shí)的腦梗死面積情況；最后采用TUNEL染色法觀察缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，并通過免疫熒光染色觀察缺血半暗帶皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞中Rb（Retinoblastomaprotein, Rb）-Id2以及Rb-E2F1的共定位情況。 結(jié)果：與生理鹽水（NaCl）注射組和misRNA注射組相比較，siRNA組大鼠缺血半暗帶皮質(zhì)Id2mRNA，Id2蛋白以及Bax蛋白的表達(dá)在腦缺血24小時(shí)和72小時(shí)均有明顯減少，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均0.01）；與NaCl注射組和misRNA注射組相比較，siRNA組大鼠在腦缺血24小時(shí)和72小時(shí)的神經(jīng)功能缺陷均有明顯改善，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均0.01）；與NaCl注射組和misRNA注射組相比較，siRNA組大鼠在腦缺血72小時(shí)的腦梗死面積有明顯縮小，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。與NaCl注射組和misRNA注射組相比較，siRNA組大鼠在腦缺血72小時(shí)后的缺血半暗帶TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。在siRNA組大鼠腦缺血72小時(shí)半暗帶皮質(zhì)中，Rb-Id2共定位的陽性細(xì)胞數(shù)（91.30±7.60）/mm2較對照組（190.40±8.60）/mm2明顯減少，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）；同時(shí)，siRNA組大鼠Rb-E2F1共定位的陽性細(xì)胞數(shù)（220.10±9.00）/mm2較對照組（137.30±6.50）/mm2明顯增多，其差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。 結(jié)論：siRNA介導(dǎo)的Id2敲低在大鼠腦缺血的治療中具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，其可能的機(jī)制為：Id2敲低后，Rb-Id2的結(jié)合減少，Rb-E2F1的結(jié)合增多，從而促使游離的E2F1減少，進(jìn)而抑制了細(xì)胞周期的進(jìn)展和神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R743.3

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2356791