【摘要】：研究背景腦出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,具有很高的發(fā)病率與死亡率。它在每年新發(fā)的卒中病例中大約占有10%-15%的比例,這個比例隨著人口平均壽命的增加而增長。在過去幾十年里,ICH總的發(fā)病率與死亡率沒有顯著下降,其30天的死亡率約為30%-50%,并且只有20%的病人能在6個月后恢復(fù)自理能力。腦出血后大量的紅細胞進入腦實質(zhì)中,這些紅細胞在早期就開始溶解并釋放出血紅蛋白。血紅蛋白在損傷部位降解,最終的降解產(chǎn)物包括鐵、膽綠素、一氧化碳等,其中鐵能夠引起一系列下游分子反應(yīng),如引起谷氨酸釋放,氧化應(yīng)激反應(yīng)等。這些應(yīng)激性反應(yīng),引起腦出血后早期的腦水腫、血腦屏障破壞以及神經(jīng)元變性等大腦損傷。腦出血后引起的一系列繼發(fā)性分子病理事件是造成進一步損傷的主要機制,尤其是谷氨酸損傷引起的鈣離子濃度升高以及氧化應(yīng)激反應(yīng)。RNF146是一種泛素化E3連接酶,研究認為它在腦缺血后具有神經(jīng)保護作用。但是,RNF146在谷氨酸損傷中的具體保護機制并不清楚。腦出血后若能及時清除血紅蛋白減少其代謝產(chǎn)物的生成,能夠極大減少神經(jīng)系統(tǒng)損害以及谷氨酸過量釋放等繼發(fā)性改變,同時使用RNF146治療可以減少其下游分子事件引起的繼發(fā)性損害。該研究結(jié)果提示:(1)腦出血后4小時就可以發(fā)生紅細胞溶解。(2)血紅蛋白代謝產(chǎn)物鐵可以引起血紅蛋白清除受體(CD163)與Haptoglobin的升高。(3)谷氨酸損傷可以引起神經(jīng)細胞發(fā)生自噬。(4)RNF146可以通過調(diào)控谷氨酸誘導(dǎo)的自噬發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本研究主要分為以下三個方面:第一部分:腦出血后早期紅細胞溶解的作用與機制研究背景:腦出血后血液從破裂血管中大量進入腦實質(zhì)中引起腦損傷。大量研究認為血液中的紅細胞是導(dǎo)致腦損傷的重要因素。一般認為紅細胞進入腦實質(zhì)后在出血后一天左右開始溶解,溶解后釋放出大量的血紅蛋白引起腦腫脹與神經(jīng)元死亡等。因此,紅細胞的溶解程度與腦損傷程度密切相關(guān)。肝素是一種抗凝劑,能夠減少血液的凝固。但是如何測定腦出血后紅細胞溶解程度仍沒有方法。肝素能否減慢紅細胞的溶解仍不可知。方法:我們的實驗分為三部分:首先,將SD大鼠分為兩組,一組注射100μl鹽水,另外一組注射100μl自體血。在4小時進行核磁掃描T2,T2*,并測量腦腫脹比率與紅細胞溶解率。再次,將SD大鼠分為兩組,一組注射50μl濃縮紅細胞,另一組注射50μl溶解紅細胞。在4小時進行核磁掃描T2,T2*以及R2*mapping,并測量腦腫脹比率與紅細胞溶解率。此外,切片進行HE染色,Fluoro-Jade C染色。免疫組化染色與Western-blot檢測Albumin蛋白水平。使用Matlab軟件分析R2*mapping圖像進行鐵定量。最后,將SD大鼠分為兩組一組注射100μl自體血加載體,另一組注射100μl自體血加5個單位肝素。在4小時同樣進行T2,T2*以及R2*mapping。并進行HE染色,Fluoro-Jade C染色。結(jié)果:我們的實驗結(jié)果證明腦出血后4小時已經(jīng)發(fā)生中線移位。從T2*影像結(jié)果得出,紅細胞溶解在4小時已經(jīng)開始發(fā)生。此外,我們使用大鼠腦直接注射溶解紅細胞與濃縮紅細胞,觀察在T2,T2*及R2*mapping上影像學(xué)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶解紅細胞組在T2*上損傷區(qū)顯示為高信號區(qū)域,濃縮紅細胞在損傷區(qū)為低信號區(qū)域。溶解紅細胞組在4小時加重了腦腫脹程度。相比于濃縮紅細胞組,溶解紅細胞組引起的血腦屏障破壞更加嚴(yán)重。最后,我們研究肝素在腦出血后早期紅細胞溶解中的作用。結(jié)果表明肝素可以減少早期紅細胞溶解,并減少腦腫脹及神經(jīng)元變性。結(jié)論:腦出血后紅細胞的溶解會引起大腦腫脹,神經(jīng)元變性以及血腦屏障的破壞。肝素可以減少早期的紅細胞溶解,并且可以減輕腦腫脹及神經(jīng)元變性。第二部分:腦出血后CD163與Haptoglobin(Hp)清除血紅蛋白的機制研究背景:腦出血是一種在年長人群發(fā)生的致死性疾病,大量的紅細胞在腦出血后進入腦組織細胞外間隙中。紅細胞的降解產(chǎn)物包括血紅蛋白,血紅素以及鐵,引起了驗證的氧化與興奮性毒性作用并且最終導(dǎo)致大腦損傷。血紅蛋白來源于血紅細胞溶解是腦出血后的主要損傷因素,血紅蛋白的毒性與氧自由基的形成與一氧化氮的清除具有密切關(guān)系。腦出血后的鐵超載可以造成大腦水腫以及大腦萎縮。前面的研究證明血紅蛋白在腦出血后表達在神經(jīng)元與膠質(zhì)細胞中。然而,降解血紅蛋白的保護機制仍然不清除。CD163屬于富含半胱氨酸的清除受體超家族,它在血紅蛋白的清除中發(fā)揮重要作用。同時CD163也是發(fā)揮抗炎作用小膠質(zhì)細胞的標(biāo)記物之一,它能夠調(diào)節(jié)巨噬細胞中血紅素氧化酶的激活。Hp是一種含量頗豐的血漿糖蛋白,能夠與血紅蛋白結(jié)合。Hp在內(nèi)源性血紅蛋白清除系統(tǒng)中具有重要作用,主要依賴于其對游離血紅蛋白的解毒作用。Hp與血紅蛋白構(gòu)成的復(fù)合體與CD163有很高的親和力。此外,研究發(fā)現(xiàn)Hp主要在大腦中主要由少突膠質(zhì)細胞合成與分泌。方法:本實驗主要分為四部分。第一部分,使用自體血注射腦出血模型檢測CD163與Hp在第一天,第三天與第7天的表達變化。第二部分,使用Fe Cl2注射SD大鼠研究鐵超載在大腦中的作用。第三部分,使用米諾環(huán)素研究其對鐵毒性與腦出血后CD163與Hp的作用。第四部分,我們使用原代小膠質(zhì)細胞研究CD163吞噬血紅蛋白的清除作用。結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)CD163與Hp在腦出血第一天開始表達在皮層區(qū)神經(jīng)元與基底節(jié)區(qū)小膠質(zhì)細胞并且在第7天達到表達高峰。CD163主要表達在皮層神經(jīng)元細胞與基底節(jié)區(qū)小膠質(zhì)細胞上。Hp主要表達在基底節(jié)白質(zhì)束區(qū)少突膠質(zhì)細胞上。鐵能夠激活CD163與Hp在皮層區(qū)與基底節(jié)區(qū)的表達。米諾環(huán)素能夠減少鐵與腦出血引起的CD163與Hp表達。CD163抗體能夠阻止小膠質(zhì)吞噬血紅蛋白的能力。結(jié)論:CD163與Hp在腦出血后一天表達升高并且在第7天達到表達高峰。鐵能夠增加CD163與Hp的表達,米諾環(huán)素治療可以減少鐵與腦出血后的CD163與Hp表達。CD163抗體可以拮抗小膠質(zhì)細胞吞噬血紅蛋白的能力。第三部分:RNF146對腦出血后谷氨酸興奮性毒性誘導(dǎo)自噬的作用與機制研究背景:谷氨酸是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)源性興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。谷氨酸興奮性毒性是造成卒中,創(chuàng)傷性腦損傷,神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病等疾病后神經(jīng)細胞死亡的主要因素之一。自噬參與降解受損或損毀的細胞器,異常蛋白質(zhì)以及其他細胞質(zhì)組分的主要代謝過程,是谷氨酸興奮性毒性后的重要細胞代謝活動。RNF146是一種PAR依賴的E3連接酶,也是一種重要的調(diào)節(jié)分子,可以調(diào)控PARP1介導(dǎo)的細胞死亡。此外,RNF146還能夠酶正性調(diào)控Wnt信號通路,這是因為RNF146參與了端錨聚合降解axin的過程。然而,目前還沒有相關(guān)研究證明該通路在谷氨酸興奮性毒性中的作用。RNF146在谷氨酸興奮性毒性的作用及自噬及其下游分子通路仍然不清楚。方法:我們的目的是檢測RNF146在谷氨酸興奮性損傷后如何調(diào)控自噬。首先,使用RNF146過表達慢病毒與干涉慢病毒轉(zhuǎn)染類神經(jīng)元細胞HT22細胞系,并對這些細胞進行MTT實驗與LDH細胞毒性實驗。其次,我們觀察自噬在谷氨酸興奮性毒性損傷中的作用,使用了藥理學(xué)試劑調(diào)控自噬觀察HT22細胞的損傷程度。此外,我們還研究了RNF146與Wnt信號通路的相關(guān)性,使用Wnt拮抗劑干擾Wnt/β-catenin信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。同時,為了研究Wnt信號通路在谷氨酸損傷后如何調(diào)控自噬,我們使用了Wnt信號的激動劑Foxy5,一種Wnt5a多肽類似物以及拮抗劑,JW74與IWP2。最后,我們還使用了Wnt/β-catenin信號通路抑制劑JW74去研究RNF146對自噬的負性調(diào)控作用。結(jié)果:本研究中,我們發(fā)現(xiàn)了上調(diào)RNF146能夠減少谷氨酸興奮性毒性引起的細胞損傷。RNF146能夠抑制谷氨酸興奮性毒性或者雷帕霉素引起的過度自噬,保護神經(jīng)元不受到損傷。此外,我們還發(fā)現(xiàn)在谷氨酸興奮性毒性中Wnt/β-catenin能夠負性調(diào)控自噬。過表達RNF146能夠通過抑制β-catenin降解復(fù)合體促進Wnt/β-catenin信號通路。結(jié)論:以上結(jié)果證明RNF146是一種神經(jīng)保護分子,能夠在谷氨酸興奮性毒性損傷保護神經(jīng)元不受到損傷。這種神經(jīng)保護作用很有可能是依賴于調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路抑制自噬。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R743.34
，

本文編號：2354132