【摘要】：缺血性腦卒中是一類嚴重危害人類健康和生命安全的疾病,其導(dǎo)致的死亡率在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中位于前列。腦缺血促發(fā)了一系列復(fù)雜的細胞效應(yīng)與分子機制,其中谷氨酸興奮性毒性損傷機制在近二十年多來研究腦缺血神經(jīng)保護中受到了較多的關(guān)注。該機制認為腦缺血后興奮性遞質(zhì)谷氨酸大量釋放,激活神經(jīng)元突觸后膜上的N-甲基-D-天門冬氨酸受體(N-Methyl-D-aspartate receptor, NMDAR),引起NMDAR突觸后致密蛋白-95(postsynaptic density-95, PSD95)/神經(jīng)元型一氧化氮合成酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)三元復(fù)合物的形成,進一步激活nNOS,產(chǎn)生大量一氧化氮(nitric oxide, NO),引起神經(jīng)元損傷。本實驗室前期研究已證明解開nNOS-PSD95耦聯(lián)可以阻斷該信號通路,保護缺血損傷；加之大量nNOS不利于神經(jīng)發(fā)生的研究報道,我們合理推測解耦聯(lián)是否可能通過降低：nNOS活性,減少NO而影響神經(jīng)發(fā)生。為此,本研究主要開展了以下工作：(1)在整體動物水平,研究腦缺血后降低nNOS-PSD95耦聯(lián)是否調(diào)控內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生。(2)動物建立腦缺血模型后,移植神經(jīng)干細胞(neural stem cells, NSCs),觀察解耦聯(lián)藥物對外源性干細胞的分化命運、遷移等的影響。(3)進行體外實驗,分細胞類型研究神經(jīng)元中nNOS-PSD95耦聯(lián)對與其共培養(yǎng)的干細胞分化命運的影響。第一章 降低缺血誘導(dǎo)的nNOS-PSD95耦聯(lián)促進內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生為了研究nNOS-PSD95解耦聯(lián)對腦內(nèi)新生神經(jīng)干細胞的存活、分化命運、遷移的影響,我們選用大鼠腹腔注射BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine)的方式標記這部分新生細胞。動物進行大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型誘導(dǎo)腦缺血損傷。缺血再灌注同時給予解耦聯(lián)化合物ZL006或溶劑,標記14天后檢測海馬齒狀回(dentate gyrus, DG)和紋狀體部位BrdU和DCX陽性細胞。結(jié)果顯示：與溶劑組相比,ZL006增加缺血側(cè)海馬DG區(qū)和紋狀體部位BrdU陽性細胞數(shù),增加BrdU/DCX雙陽性細胞占總BrdU陽性細胞數(shù)的比例,說明ZL006能提高腦缺血前新生細胞的存活率,并且促進這部分新生細胞向神經(jīng)元分化。比較兩組動物側(cè)腦室至紋狀體部位的腦組織切片,我們發(fā)現(xiàn)ZL006組DCX陽性細胞的突起總長度大于溶劑組,并且這些細胞向紋狀體損傷區(qū)的遷移范圍擴大,遷移距離增加,說明ZL006有利于新生細胞成熟,并促進其向損傷區(qū)遷移。鑒于生理情況下nNOS與PSD95存在一定量的耦聯(lián),我們也研究了在生理情況下給予ZL006對BrdU標記的新生細胞的影響。結(jié)果顯示：給予ZL006輕微增加海馬DG區(qū)BrdU陽性細胞數(shù),提高BrdU/DCX雙陽性細胞占總BrdU陽性細胞數(shù)的比例,同時也能增加DG區(qū)顆粒細胞層中BrdU陽性細胞數(shù),但均沒有統(tǒng)計學(xué)差異。此外,ZL006不增加側(cè)腦室室下區(qū)新生細胞的量,同時也不影響其遷移。以上數(shù)據(jù)說明生理情況下給予ZL006輕微促進海馬DG區(qū)神經(jīng)發(fā)生,但不影響側(cè)腦室室下區(qū)神經(jīng)發(fā)生。為充分驗證解耦聯(lián)靶點在內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生中的作用,我們構(gòu)建了慢病毒LV-nNOS-N1-133-GFP,并重復(fù)了ZL006對腦缺血前新生細胞影響的實驗。實驗結(jié)果與ZL006部分的數(shù)據(jù)如出一轍。但由于病毒立體定位于缺血側(cè)紋狀體部位,對海馬神經(jīng)發(fā)生不影響。這部分數(shù)據(jù)表明：LV-nNOS1-33-GFP提高缺血后新生細胞存活率,利于新生細胞向神經(jīng)元分化,并促進新生神經(jīng)元向損傷區(qū)遷移。為了研究nNOS-PSD95解耦聯(lián)對腦缺血誘導(dǎo)的新生細胞是否有影響,我們用BrdU標記了缺血后第6天至第7天的新生細胞,并在缺血的同時及之后一周一直給予ZL006。結(jié)果顯示：末次注射BrdU后2h,兩組間對照側(cè)和缺血側(cè)海馬DG區(qū)BrdU陽性細胞數(shù)均沒有明顯差異,然而,在末次注射BrdU后第28天,ZL006組缺血側(cè)海馬DG區(qū)BrdU陽性細胞數(shù)顯著高于溶劑組,但對照側(cè)兩組間無明顯差異。根據(jù)2h和28天時的數(shù)據(jù)計算BrdU存活率,得出對照側(cè)和缺血側(cè)ZL006組BrdU陽性細胞存活百分比都高于溶劑組。以上數(shù)據(jù)說明,ZL006不僅利于腦缺血前新生細胞存活與神經(jīng)發(fā)生,還能提高腦缺血后新生細胞的存活率。第二章缺血誘導(dǎo)的nNOS-PSD95耦聯(lián)對外源性移植神經(jīng)干細胞的影響本章研究中,我們對腦缺血大鼠立體定位移植了GFP陽性神經(jīng)干細胞,在缺血同時及之后一周給予解耦聯(lián)化合物ZL006,觀察nNOS-PSD95解耦聯(lián)對外源性移植神經(jīng)干細胞的作用。結(jié)果顯示：在注射區(qū)、胼胝體和紋狀體這3個部位,ZL006組GFP陽性細胞數(shù)均高于溶劑組,說明腦缺血后給予ZL006促進外源性移植神經(jīng)干細胞的存活和遷移。此外,我們在ZL006組動物的紋狀體部位觀察到了少量的GFP/NeuN雙陽性細胞,并且這部分細胞能與GABA能神經(jīng)元標記物GAD67共標,而溶劑組中未觀察到,說明ZL006能促進外源性移植神經(jīng)干細胞向特定類型的神經(jīng)元分化,有利于外源性神經(jīng)發(fā)生。第三章體外實驗探究神經(jīng)元中nNOS-PSD95耦聯(lián)對神經(jīng)干細胞命運的調(diào)控本章中我們在細胞水平研究了nNOS-PSD95解耦聯(lián)對神經(jīng)發(fā)生的影響。通過免疫印跡分析,我們明確nNOS-PSD95耦聯(lián)靶點只存在于神經(jīng)元中。另外,DAF-FM DA熒光探針實驗證明解耦聯(lián)藥物ZL006可以降低神經(jīng)元在氧糖剝奪模型(Oxygen and Glucose Deprivation, OGD)下NO的生成量。在此基礎(chǔ)上,我們采用神經(jīng)干細胞與神經(jīng)元共培養(yǎng)簡單模擬腦內(nèi)細胞間相互作用,共培養(yǎng)細胞在OGD的同時給予ZL006或解耦聯(lián)多肽Tat-nNOS-N1-133,干細胞分化5至6天后進行分析。結(jié)果顯示：ZL006能逆轉(zhuǎn)OGD介導(dǎo)的不利效應(yīng),提高干細胞向神經(jīng)元分化的比例,輕微降低其向星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞分化。此外,ZL006有利于新生神經(jīng)元的突起生長,增加多突起神經(jīng)元占總分化細胞的比例。用Tat-nNOS-N1-133重復(fù)ZL006的實驗內(nèi)容,我們得到了相同的數(shù)據(jù)。這些結(jié)果表明,OGD后,神經(jīng)元中nNOS-PSD95解耦聯(lián)促進與其共培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化。繼而,我們用nNOS基因敲除的神經(jīng)元與正常神經(jīng)干細胞共培養(yǎng),也同樣進行OGD造模和給予解耦聯(lián)藥物,結(jié)果顯示：該條件下OGD因素并不影響干細胞向神經(jīng)元分化的比例,藥物ZL006在其中也沒有發(fā)揮任何作用。說明解耦聯(lián)靶點對于影響干細胞的分化命運是必需的。由于細胞是共培養(yǎng)體系,我們還驗證了單純OGD因素和藥物因素對干細胞的影響,結(jié)果顯示：OGD雖然提高干細胞向神經(jīng)元分化比例,但抑制新生神經(jīng)元突起生長；在OGD造模的同時給予藥物,并不能逆轉(zhuǎn)該效應(yīng),證明干細胞中不存在藥物作用的靶點。因為OGD對單獨培養(yǎng)干細胞的效應(yīng)與共培養(yǎng)狀態(tài)下干細胞的效應(yīng)是相反的,所以并不妨礙我們得出共培養(yǎng)時的結(jié)論：OGD后,神經(jīng)元中nNOS-PSD95解耦聯(lián)促進與其共培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化。在實驗過程中,我們一并研究了nNOS-PSD95解耦聯(lián)對神經(jīng)元自身的作用,結(jié)果表明,解耦聯(lián)藥物可以保護神經(jīng)元缺血損傷,改善缺血神經(jīng)元突觸發(fā)生。結(jié)論：(1)降低缺血誘導(dǎo)的nNOS-PSD95耦聯(lián)促進內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生；(2)降低缺血誘導(dǎo)的nNOS-PSD95耦聯(lián)促進外源性神經(jīng)發(fā)生；(3)神經(jīng)元中nNOS-PSD95解耦聯(lián)在保護自身缺血損傷的同時,促進與其共培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化。
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【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R743.3

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1 錢曉丹;神經(jīng)元nNOS-PSD95耦聯(lián)對腦缺血后神經(jīng)干細胞命運調(diào)控的作用[D];南京醫(yī)科大學(xué);2014年

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本文編號：2348659