【摘要】：缺血性腦卒中是一類嚴(yán)重危害人類健康和生命安全的疾病,其導(dǎo)致的死亡率在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中位于前列。腦缺血促發(fā)了一系列復(fù)雜的細(xì)胞效應(yīng)與分子機(jī)制,其中谷氨酸興奮性毒性損傷機(jī)制在近二十年多來研究腦缺血神經(jīng)保護(hù)中受到了較多的關(guān)注。該機(jī)制認(rèn)為腦缺血后興奮性遞質(zhì)谷氨酸大量釋放,激活神經(jīng)元突觸后膜上的N-甲基-D-天門冬氨酸受體(N-Methyl-D-aspartate receptor, NMDAR),引起NMDAR突觸后致密蛋白-95(postsynaptic density-95, PSD95)/神經(jīng)元型一氧化氮合成酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)三元復(fù)合物的形成,進(jìn)一步激活nNOS,產(chǎn)生大量一氧化氮(nitric oxide, NO),引起神經(jīng)元損傷。本實(shí)驗(yàn)室前期研究已證明解開nNOS-PSD95耦聯(lián)可以阻斷該信號(hào)通路,保護(hù)缺血損傷；加之大量nNOS不利于神經(jīng)發(fā)生的研究報(bào)道,我們合理推測(cè)解耦聯(lián)是否可能通過降低：nNOS活性,減少NO而影響神經(jīng)發(fā)生。為此,本研究主要開展了以下工作：(1)在整體動(dòng)物水平,研究腦缺血后降低nNOS-PSD95耦聯(lián)是否調(diào)控內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生。(2)動(dòng)物建立腦缺血模型后,移植神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs),觀察解耦聯(lián)藥物對(duì)外源性干細(xì)胞的分化命運(yùn)、遷移等的影響。(3)進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),分細(xì)胞類型研究神經(jīng)元中nNOS-PSD95耦聯(lián)對(duì)與其共培養(yǎng)的干細(xì)胞分化命運(yùn)的影響。第一章 降低缺血誘導(dǎo)的nNOS-PSD95耦聯(lián)促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生為了研究nNOS-PSD95解耦聯(lián)對(duì)腦內(nèi)新生神經(jīng)干細(xì)胞的存活、分化命運(yùn)、遷移的影響,我們選用大鼠腹腔注射BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine)的方式標(biāo)記這部分新生細(xì)胞。動(dòng)物進(jìn)行大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型誘導(dǎo)腦缺血損傷。缺血再灌注同時(shí)給予解耦聯(lián)化合物ZL006或溶劑,標(biāo)記14天后檢測(cè)海馬齒狀回(dentate gyrus, DG)和紋狀體部位BrdU和DCX陽(yáng)性細(xì)胞。結(jié)果顯示：與溶劑組相比,ZL006增加缺血側(cè)海馬DG區(qū)和紋狀體部位BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),增加BrdU/DCX雙陽(yáng)性細(xì)胞占總BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比例,說明ZL006能提高腦缺血前新生細(xì)胞的存活率,并且促進(jìn)這部分新生細(xì)胞向神經(jīng)元分化。比較兩組動(dòng)物側(cè)腦室至紋狀體部位的腦組織切片,我們發(fā)現(xiàn)ZL006組DCX陽(yáng)性細(xì)胞的突起總長(zhǎng)度大于溶劑組,并且這些細(xì)胞向紋狀體損傷區(qū)的遷移范圍擴(kuò)大,遷移距離增加,說明ZL006有利于新生細(xì)胞成熟,并促進(jìn)其向損傷區(qū)遷移。鑒于生理情況下nNOS與PSD95存在一定量的耦聯(lián),我們也研究了在生理情況下給予ZL006對(duì)BrdU標(biāo)記的新生細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示：給予ZL006輕微增加海馬DG區(qū)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),提高BrdU/DCX雙陽(yáng)性細(xì)胞占總BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比例,同時(shí)也能增加DG區(qū)顆粒細(xì)胞層中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),但均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外,ZL006不增加側(cè)腦室室下區(qū)新生細(xì)胞的量,同時(shí)也不影響其遷移。以上數(shù)據(jù)說明生理情況下給予ZL006輕微促進(jìn)海馬DG區(qū)神經(jīng)發(fā)生,但不影響側(cè)腦室室下區(qū)神經(jīng)發(fā)生。為充分驗(yàn)證解耦聯(lián)靶點(diǎn)在內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生中的作用,我們構(gòu)建了慢病毒LV-nNOS-N1-133-GFP,并重復(fù)了ZL006對(duì)腦缺血前新生細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與ZL006部分的數(shù)據(jù)如出一轍。但由于病毒立體定位于缺血側(cè)紋狀體部位,對(duì)海馬神經(jīng)發(fā)生不影響。這部分?jǐn)?shù)據(jù)表明：LV-nNOS1-33-GFP提高缺血后新生細(xì)胞存活率,利于新生細(xì)胞向神經(jīng)元分化,并促進(jìn)新生神經(jīng)元向損傷區(qū)遷移。為了研究nNOS-PSD95解耦聯(lián)對(duì)腦缺血誘導(dǎo)的新生細(xì)胞是否有影響,我們用BrdU標(biāo)記了缺血后第6天至第7天的新生細(xì)胞,并在缺血的同時(shí)及之后一周一直給予ZL006。結(jié)果顯示：末次注射BrdU后2h,兩組間對(duì)照側(cè)和缺血側(cè)海馬DG區(qū)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均沒有明顯差異,然而,在末次注射BrdU后第28天,ZL006組缺血側(cè)海馬DG區(qū)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著高于溶劑組,但對(duì)照側(cè)兩組間無明顯差異。根據(jù)2h和28天時(shí)的數(shù)據(jù)計(jì)算BrdU存活率,得出對(duì)照側(cè)和缺血側(cè)ZL006組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞存活百分比都高于溶劑組。以上數(shù)據(jù)說明,ZL006不僅利于腦缺血前新生細(xì)胞存活與神經(jīng)發(fā)生,還能提高腦缺血后新生細(xì)胞的存活率。第二章缺血誘導(dǎo)的nNOS-PSD95耦聯(lián)對(duì)外源性移植神經(jīng)干細(xì)胞的影響本章研究中,我們對(duì)腦缺血大鼠立體定位移植了GFP陽(yáng)性神經(jīng)干細(xì)胞,在缺血同時(shí)及之后一周給予解耦聯(lián)化合物ZL006,觀察nNOS-PSD95解耦聯(lián)對(duì)外源性移植神經(jīng)干細(xì)胞的作用。結(jié)果顯示：在注射區(qū)、胼胝體和紋狀體這3個(gè)部位,ZL006組GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均高于溶劑組,說明腦缺血后給予ZL006促進(jìn)外源性移植神經(jīng)干細(xì)胞的存活和遷移。此外,我們?cè)赯L006組動(dòng)物的紋狀體部位觀察到了少量的GFP/NeuN雙陽(yáng)性細(xì)胞,并且這部分細(xì)胞能與GABA能神經(jīng)元標(biāo)記物GAD67共標(biāo),而溶劑組中未觀察到,說明ZL006能促進(jìn)外源性移植神經(jīng)干細(xì)胞向特定類型的神經(jīng)元分化,有利于外源性神經(jīng)發(fā)生。第三章體外實(shí)驗(yàn)探究神經(jīng)元中nNOS-PSD95耦聯(lián)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)控本章中我們?cè)诩?xì)胞水平研究了nNOS-PSD95解耦聯(lián)對(duì)神經(jīng)發(fā)生的影響。通過免疫印跡分析,我們明確nNOS-PSD95耦聯(lián)靶點(diǎn)只存在于神經(jīng)元中。另外,DAF-FM DA熒光探針實(shí)驗(yàn)證明解耦聯(lián)藥物ZL006可以降低神經(jīng)元在氧糖剝奪模型(Oxygen and Glucose Deprivation, OGD)下NO的生成量。在此基礎(chǔ)上,我們采用神經(jīng)干細(xì)胞與神經(jīng)元共培養(yǎng)簡(jiǎn)單模擬腦內(nèi)細(xì)胞間相互作用,共培養(yǎng)細(xì)胞在OGD的同時(shí)給予ZL006或解耦聯(lián)多肽Tat-nNOS-N1-133,干細(xì)胞分化5至6天后進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：ZL006能逆轉(zhuǎn)OGD介導(dǎo)的不利效應(yīng),提高干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的比例,輕微降低其向星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化。此外,ZL006有利于新生神經(jīng)元的突起生長(zhǎng),增加多突起神經(jīng)元占總分化細(xì)胞的比例。用Tat-nNOS-N1-133重復(fù)ZL006的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,我們得到了相同的數(shù)據(jù)。這些結(jié)果表明,OGD后,神經(jīng)元中nNOS-PSD95解耦聯(lián)促進(jìn)與其共培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。繼而,我們用nNOS基因敲除的神經(jīng)元與正常神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng),也同樣進(jìn)行OGD造模和給予解耦聯(lián)藥物,結(jié)果顯示：該條件下OGD因素并不影響干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的比例,藥物ZL006在其中也沒有發(fā)揮任何作用。說明解耦聯(lián)靶點(diǎn)對(duì)于影響干細(xì)胞的分化命運(yùn)是必需的。由于細(xì)胞是共培養(yǎng)體系,我們還驗(yàn)證了單純OGD因素和藥物因素對(duì)干細(xì)胞的影響,結(jié)果顯示：OGD雖然提高干細(xì)胞向神經(jīng)元分化比例,但抑制新生神經(jīng)元突起生長(zhǎng)；在OGD造模的同時(shí)給予藥物,并不能逆轉(zhuǎn)該效應(yīng),證明干細(xì)胞中不存在藥物作用的靶點(diǎn)。因?yàn)镺GD對(duì)單獨(dú)培養(yǎng)干細(xì)胞的效應(yīng)與共培養(yǎng)狀態(tài)下干細(xì)胞的效應(yīng)是相反的,所以并不妨礙我們得出共培養(yǎng)時(shí)的結(jié)論：OGD后,神經(jīng)元中nNOS-PSD95解耦聯(lián)促進(jìn)與其共培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。在實(shí)驗(yàn)過程中,我們一并研究了nNOS-PSD95解耦聯(lián)對(duì)神經(jīng)元自身的作用,結(jié)果表明,解耦聯(lián)藥物可以保護(hù)神經(jīng)元缺血損傷,改善缺血神經(jīng)元突觸發(fā)生。結(jié)論：(1)降低缺血誘導(dǎo)的nNOS-PSD95耦聯(lián)促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生；(2)降低缺血誘導(dǎo)的nNOS-PSD95耦聯(lián)促進(jìn)外源性神經(jīng)發(fā)生；(3)神經(jīng)元中nNOS-PSD95解耦聯(lián)在保護(hù)自身缺血損傷的同時(shí),促進(jìn)與其共培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R743.3

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 錢曉丹;神經(jīng)元nNOS-PSD95耦聯(lián)對(duì)腦缺血后神經(jīng)干細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控的作用[D];南京醫(yī)科大學(xué);2014年

，

本文編號(hào)：2348659