【摘要】：腦膠質瘤是一類常見、難治、重要的危害人類健康疾病，其中惡性膠質瘤占所有原發(fā)惡性腦腫瘤的80%，預后差，病死率高，即使手術切除后復發(fā)率仍高達70%~90%，膠質母細胞瘤與間變型星形膠質瘤的中位生存期分別只有12~15個月與2~5年，5年生存率分別僅為4.7%和25.9%。盡管隨現(xiàn)代科技進步，新技術和新藥物不斷應用，手術、放化療、免疫、基因治療或其組合的綜合措施取得了一定進展，但惡性膠質瘤的總體預后并未得到根本的改善，因此，闡明腦膠質瘤分子病理機制，尋找新的治療靶點和策略以及可用于判斷預測腦膠質瘤預后的相關分子靶標，從而提高膠質瘤的綜合療效已成為神經(jīng)外科領域的前沿課題。 腦膠質瘤的惡變是基因畸變的積累與生長因子信號通路異常調控的結果，這一過程包含了PI3K、p53、RB、MAPK等多條通路，并可能涉及到腫瘤細胞粘附、基質降解、遷移、細胞增殖等諸多環(huán)節(jié)，但目前其具體的機制仍不清楚。因此，腦膠質瘤治療取得突破的關鍵因素就是找到其發(fā)生、增殖、侵襲過程中的上游核心調控基因，針對這些關鍵調控基因的分子靶向療法則是膠質瘤治療的新思路和新方向。挖掘出既能反應膠質瘤的生物學特性，又能輔助制定放化療策略和預測預后的特征性分子靶標具有重要的臨床意義，以實現(xiàn)真正意義上的分子靶向治療。 高通量技術的出現(xiàn)無疑為分子靶向治療的實現(xiàn)提供強有力的工具。利用二代測序、基因芯片、組織芯片等技術不僅能對腫瘤樣本進行分析，分辨疾病的亞型，還可以預測疾病的預后和對藥物、放射線的敏感性，進而實施個體化治療。在治療中我們發(fā)現(xiàn)，即使是相同病理類型和級別的膠質瘤，同樣的治療方法，其治療效果也存在著很大的差異。腫瘤的內在分子水平上的差異是導致這一現(xiàn)象的最關鍵因素。若在治療前，就能預先發(fā)現(xiàn)特殊的腫瘤基因的突變、缺失等各種表型改變，進而可判斷患者對治療的反應和預后，則毫無疑問能為治療提供更多的選擇性和針對性并可能顯著提高療效。目前已有文獻報道MGMT、IDH1、1p/19q等多個基因的甲基化、突變或缺失可用于判斷部分膠質瘤亞型對替莫唑胺等化療藥物的敏感性，并且可作為預后判斷的重要指標，但這些著名靶標尚沒有膠質瘤的特異性。 近年來，轉錄后水平的調控分子在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的作用不斷被揭示，越來越多的證據(jù)表明，特定mRNA的轉錄后調控與腫瘤相關基因表達水平變化密切相關，且這種調控主要是通過3'非翻譯區(qū)的順式作用元件實現(xiàn)的。胞質聚腺苷酸化元件（Cytoplasmic polyadenylation element，CPE）即為已知的元件之一，在上百種涉及細胞增殖及分化的mRNA上均有表達。CPE結合蛋白（CPEB）是一組高度保守，包含有RNA識別序列及鋅指結構的RNA結合蛋白，能夠促進多聚腺苷酸化誘導的翻譯過程并能介導包括干細胞發(fā)育、細胞分化和細胞衰老等過程。CPEB4是CPEB家族中的一員，已有研究發(fā)現(xiàn)其在胰腺癌組織中過表達，且表達水平高低與腫瘤惡性程度成正相關；另有文獻報道CPEB4在GBM中過表達（同一篇文獻？），但CPEB4表達量與腫瘤惡性程度、發(fā)生發(fā)展、增殖侵襲及預后的關系，國際上尚無文獻報道。因此，本實驗從組織水平和細胞水平，通過高通量組織芯片、靶向RNA干擾慢病毒載體構建、RT-PCR、Western blot，以及細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡等體外實驗方法，探索研究CPEB4蛋白表達量與患者預后的關系，并初步探討其在膠質瘤細胞中的功能表型及可能的通路和分子機制。 第一部分：CPEB4在腦膠質瘤組織中的表達及預后相關研究 目的：CPEB4是CPEB家族中的重要一員，在細胞生理和病理過程中，調控有絲分裂、減數(shù)分裂細胞周期及細胞衰老，其在轉錄后調控中的重要作用，提示可能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關，但其在膠質瘤領域中研究尚很少。本部分實驗通過構建高通量組織芯片和免疫組化的方法，研究CPEB4在各級別膠質瘤組織中的表達情況，并分析CPEB4的表達量與膠質瘤預后的關系。 方法：1）、收集經(jīng)臨床病理證實為膠質瘤的病理標本共計300例（通過2000年1月至2010年12月第二軍醫(yī)大學長征醫(yī)院神經(jīng)外科腫瘤切除手術取得）；正常腦組織16例（通過外傷減壓手術取得）；制備成高通量的膠質瘤組織芯片；2）、利用組織芯片、免疫組化方法研究CPEB4在腫瘤細胞中的亞定位及其蛋白在各個級別膠質瘤和正常腦組織中的表達情況，并分析級別與表達量的關系；3）、對300例膠質瘤患者進行隨訪，獲得其生存期，分析CPEB4表達量與膠質瘤患者生存期的關系。 結果：在正常腦組織中CPEB4主要表達在神經(jīng)元內，在膠質細胞中表達很少；在膠質瘤細胞中CPEB4主要表達在胞漿內，各級別膠質瘤中的表達均高于正常腦組織(P0.05)，其表達強度隨級別增高而增高，呈正相關，低級別和高級別膠質瘤之間的表達差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；CPEB4的表達量與膠質瘤患者的預后有相關性，Log-rank單因素分析顯示CPEB4表達高者的總體生存期（OS）和無進展生存期（PFS）較CPEB4表達低者均明顯縮短，統(tǒng)計學差異顯著（P值均＜0.001），但經(jīng)病理級別校正后P值分別為0.065和0.059，提示CPEB4表達量與膠質瘤患者預后的相關性受到病理級別的影響。在原發(fā)GBM中，Log-rank單因素分析顯示高表達CPEB4患者的OS和PFS均明顯低于低表達者（兩者p值均為0.011），Cox多因素分析顯示CPEB4表達水平是原發(fā)GBM患者OS和PFS的獨立預后相關因素（OS:HR=2.017, p=0.003；PFS: HR=1.810,p=0.009）。 結論：正常腦組織中CPEB4僅少量表達在神經(jīng)元中。膠質瘤細胞中CPEB4主要表達在細胞胞漿內，其表達水平與膠質瘤病理級別密切相關，提示CPEB4可能參與到膠質瘤的發(fā)生發(fā)展、增殖侵襲等過程中。在原發(fā)GBM患者中，CPEB4表達量與預后相關性顯著，是原發(fā)GBM患者預后的獨立相關因素，提示CPEB4是一個潛在的原發(fā)GBM的預后判斷靶標。 第二部分：CPEB4參與膠質瘤增殖侵襲的體外實驗研究和機制探索 目的：在上一部分中我們已證明CPEB4在膠質瘤組織中呈高表達，且其表達水平隨腫瘤病理級別升高而上升，呈正相關，提示CPEB4可能與膠質瘤的惡性生物學行為密切相關。在本部分中，擬構建靶向CPEB4干擾的穩(wěn)定慢病毒載體，轉染膠質瘤細胞，在體外實驗中研究CPEB4表達水平改變對膠質瘤細胞惡性生物學行為的影響，，并探討可能的通路和機制。 方法：1）設計siRNA靶點，合成高效干擾序列，與慢病毒載體連接，并利用熒光顯微鏡，定量RT-PCR、Western blot驗證RNA干擾效果；2）靶向CPEB4的RNA干擾慢病毒載體感染膠質瘤T98細胞后，MTT法檢測細胞增殖曲線變化、流式細胞儀測腫瘤細胞周期與凋亡；3）、熒光定量PCR檢測CPEB4表達量改變后膠質瘤增殖、侵襲、耐藥等相關分子表達量的變化。 結果：靶向CPEB4的RNA干擾和過表達慢病毒載體感染膠質瘤細胞后有效的改變了細胞內源性CPEB4的表達水平，與對照組相比差異顯著。CPEB4表達量降低后，膠質瘤細胞增殖能力減弱，細胞周期停滯于G1期，但細胞凋亡無明顯改變。CPEB4表達量降低后，腫瘤相關重要分子SMAD3、PIK3CA和IGF2的mRNA表達水平明顯降低。 結論：CPEB4參與調控了膠質瘤細胞的增殖侵襲，SMAD3、PIK3CA、IGF2可能參與其中發(fā)揮作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41

【共引文獻】

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本文編號：2336900