發(fā)布時間：2018-11-09 17:33

【摘要】：肌強直綜合征(Myotonic myopathies,MM)是一組原發(fā)/繼發(fā)離子通道蛋白(CL-/Na+/Ca2+/K+)結(jié)構(gòu)/功能異常、骨骼肌細胞膜去極化紊亂、持續(xù)重復(fù)放電的遺傳性骨骼肌疾病,臨床表現(xiàn)為:肌肉僵直/肌強直、肌肉萎縮/肥大、肌無力;電生理呈典型肌強直電位,伴/不伴肌病電位。根據(jù)臨床癥狀分為萎縮性肌強直(Dystrophic myotonia,DM)及非萎縮性肌強直(Non-dystrophic myotonias,NDMs)。萎縮性肌強直亦稱“強直性肌營養(yǎng)不良”(Myotonic dystrophies,DMs),呈常染色體顯性遺傳(Autosomal dominant,AD),全球發(fā)病率2.45~5.5/10萬,分為強直性肌營養(yǎng)不良Ⅰ型(Dystrophia myotonica 1,DM1)及強直性肌營養(yǎng)不良Ⅱ型(Dystrophia myotonica2,DM2)兩個亞型。DM1致病基因為DMPK,定位于19q13.3,3’端非編碼UTR區(qū)的(CTG)n重復(fù)序列異常擴增產(chǎn)生“RNA細胞毒性”作用,繼發(fā)引起骨骼肌細胞膜氯離子(CLC-1)通道蛋白m RNA剪切缺陷-轉(zhuǎn)錄本異常-骨骼肌細胞膜上CLC-1通道蛋白功能異常CL-電流幅度下降,骨骼肌細胞持續(xù)收縮導(dǎo)致肌強直癥狀。除引起DMs骨骼肌癥狀外,“RNA毒性聚集灶”還通過影響其他組織細胞蛋白pre-m RNA選擇性剪切過程,導(dǎo)致剪接產(chǎn)物“不相稱”表達,出現(xiàn)心臟、內(nèi)分泌、中樞神經(jīng)等多系統(tǒng)受累,使本病呈“合成表型”臨床表現(xiàn)。DM2致病基因Znf9,定位于3q21.3,1號內(nèi)含子(CCTG)n重復(fù)序列異常擴增致病。研究證實:DM2與DM1發(fā)病機制相同且臨床表型相似。非萎縮性肌強直(Non-Myotonic dystrophies,NDMs)是一組離子通道蛋白亞單位編碼基因變異,骨骼肌細胞膜興奮性增高持續(xù)重復(fù)放電為特征的一組遺傳性骨骼肌疾病。綜合發(fā)病率約1:100,000。臨床表現(xiàn)肌強直、肌容過飽滿(運動員體魄)、肌無力(持續(xù)/周期性發(fā)作)、易疲勞,可伴疼痛,偶累及心臟、呼吸功能。根據(jù)致病基因、編碼蛋白、臨床表型分為先天性肌強直(Myotonia congenital,MC)、先天性副肌強直(Paramyotonia congenital,PC)、高鉀型周期性癱瘓伴肌強直(Hyperkalemic periodic paralysis,Hyper PP),鉀加重型肌強直(Potassium-aggravated myotonia,PAM)、低鉀型周期性癱瘓(Hypokalemic periodic paralysis,Hypo PP)伴肌強直。MC根據(jù)遺傳方式分為AD遺傳-Thomsen's肌強直(DMC)及AR遺傳-Becker’s肌強直(RMC)。發(fā)病率為0.3~0.6/10萬,致病基因CLCN-1,位于7q35,編碼CLC-1蛋白,分布在骨骼肌、心肌等部位。CLCN-1變異致CL-通道抑制性去極化改變、CL-電流抑制減弱出現(xiàn)肌強直癥狀。基本臨床表現(xiàn):肌強直(叩擊性“肌球”,握拳伸直困難),部分患者伴肌容飽滿,“加溫”現(xiàn)象。PC呈AD遺傳,亞洲人群發(fā)病報道較少,歐洲發(fā)病率約1/350,000-380,000。致病基因SCN4A,位于17q23.1-25.3,編碼Na+通道α亞單位,廣泛分布在骨骼肌、心肌及周圍神經(jīng)系統(tǒng)。SCN4A變異致α-Na+通道功能獲得性改變-Na+持續(xù)進入肌細胞內(nèi),肌細胞膜去極化延長,臨床出現(xiàn)肌強直癥狀。PC多10歲前發(fā)病,突發(fā)/遇冷誘發(fā)性肌強直、運動后加重肌強直起病。Hyper PP、PAM與PC互為等位基因病。PAM是一組AD遺傳性骨骼肌疾病。SCN4A基因變異-Na+電流異常,同時影響K+去極化-骨骼肌細胞舒張障礙。臨床表現(xiàn)寒冷、饑餓、精神緊張等因素誘發(fā)的肌強直�；�-臨床表型相關(guān)性使該組疾病呈現(xiàn)較強的臨床/遺傳異質(zhì)性。家族性低鉀性周期性癱瘓(Family Hypokalemic periodic paralysis,FHypo PP)、Anderson低鉀性周期性癱瘓、惡性高熱和中央軸空病互為等位基因病。CACNA1S基因變異致病,呈AD遺傳,CACNA1S定位于1q31-32,長度90Kb,由44個外顯子組成編碼骨骼肌CACNA1S受體,分布于心肌、骨骼肌、周圍神經(jīng)系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)。CACNA1S變異與SCN4A相似性,基因變異影響通道失活,但并不影響依賴電壓的激活過程。電生理檢查對肌強直綜合征診斷有重要意義。電生理均呈現(xiàn)肌強直電位。致病基因差異導(dǎo)致短時肌肉運動后的復(fù)合肌肉動作電位振幅瞬時改存在差異,如:MC肌肉運動停止時動作電位振幅迅速恢復(fù)到基線水平;PC肌肉運動停止時延遲返回基線。而DMs肌電圖呈典型肌強直電位與肌病電位的雙重表現(xiàn)。活檢骨骼肌病理證實:DMs可見肌纖維直徑大小不一,肥大肌纖維、分裂肌纖維增多,無神經(jīng)支配的小角化改變;變性、壞死、再生肌纖維少見,典型核內(nèi)移、核聚集、肌漿塊等退行性改變。DM1與DM2不同分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)使其受累肌纖維有所不同,如:DM1以I型纖維萎縮為主,II型肌纖維相對優(yōu)勢;DM2以II型肌纖維萎縮為主,呈現(xiàn)明顯的I型纖維優(yōu)勢。NDMs活檢骨骼肌正常/輕度肌源性改變。但上述骨骼肌病理改變并非該組疾病特異性病理結(jié)構(gòu)改變。因此,很難通過活檢骨骼肌病理結(jié)構(gòu)進行精準(zhǔn)診斷及鑒別診斷。精準(zhǔn)測序技術(shù)及二代測序技術(shù)為肌強直綜合征分型診斷及鑒別診斷帶來了高效、突破性進展。尤其是對于NDMs分型及鑒別診斷。但DMs屬核苷酸重復(fù)序列變性病,理論上聚合酶連式反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)可明確異常擴增重復(fù)序列數(shù)(致病性),但大片段致病重復(fù)序列數(shù)及模板本身高GC含量形成的復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)限制擴增反應(yīng);重復(fù)序列動態(tài)突變形成的不穩(wěn)定性等因素大大限制了酶反應(yīng)活性,使簡潔、高效DMs分子診斷仍存在難度。本研究基于骨骼肌遺傳資源標(biāo)本庫(2004.9-2014.12),從1356例骨骼肌疾病篩選強直性肌營養(yǎng)不良(25例,含6例家系)、非萎縮性肌強直(17例,含5例家系),進行肌強直綜合征的臨床及分子生物學(xué)研究,旨在建立DMs及NDMs分子生物學(xué)診斷平臺,報告中國人群肌強直綜合征基因變異特點,回顧性分析臨床及骨骼肌病理特點,豐富肌強直綜合征的臨床表型及遺傳表型,嘗試鈉通道阻滯劑(卡馬西平/美西律)治療肌強直綜合征,減輕臨床癥狀,為產(chǎn)前診斷提供分子生物學(xué)依據(jù)。第一部分優(yōu)化PCR應(yīng)用于強直性肌營養(yǎng)不良分子生物學(xué)診斷目的:DMs由DMPK(DM1)/Znf9(DM2)非編碼區(qū)(CTG)n/(CCTG)n核苷酸重復(fù)序列異常擴增致病。DMPK由3’-UTR(CTG)n異常重復(fù)擴增致病。正常人n=5~37,n38即為異常,n=38~49突變前等位基因(Premutation alleles);n=50~100原突變等位基因(Protomutation alleles),因此n100無顯著臨床癥狀;n=100~40000突變等位基因(Mutation alleles)。DM1具備典型“遺傳早現(xiàn)”及“Parental-gender effect”效應(yīng),通過(CTG)n重復(fù)序列數(shù)可進行臨床表型及發(fā)病年齡預(yù)測。DM2由Znf9 1號內(nèi)含子區(qū)域(TG)n(TCTG)n(CCTG)n結(jié)構(gòu)中(CCTG)n片段異常重復(fù)擴增致病。正常人n=26~44;患者n=75~11000以上,平均為5000次。(CCTG)n重復(fù)數(shù)明確多用于該病診斷及鑒別診斷。DMs高度臨床/遺傳異質(zhì)性以及基因變異特點,使PCR方法檢測核苷酸重復(fù)序列數(shù)成為其最終診斷的可靠方法。大片段核苷酸序列的擴增及模板高GC含量對擴增效率的影響顯著限制PCR診斷效率,建立符合DM基因變異特點的分子生物診斷方法是臨床的迫切需求,優(yōu)化傳統(tǒng)PCR引物序列,變性、退火及延長等反應(yīng)程序檢測核苷酸重復(fù)序列數(shù)目,是本研究的技術(shù)關(guān)鍵。方法1根據(jù)International Myotonic Dystrophy Consotium診斷標(biāo)準(zhǔn)在2004-2014年遺傳性骨骼肌疾病資料標(biāo)本庫中標(biāo)本篩選42例肌強直綜合征患者(11例家系)作為優(yōu)化PCR檢測對象。2基因分析①簽署知情同意書,抽取2ml外周靜脈血提取基因組DNA。以Primer5.0軟件進行PCR反應(yīng)引物序列設(shè)計,覆蓋DMPK,ZNF9基因全長。②傳統(tǒng)PCR反應(yīng)參數(shù)優(yōu)化,包括變性、退火、延伸階段時間、溫度。③對上述入選病例及家系成員進行DMPK及Znf9擴增,2.5%瓊脂糖凝膠電泳進行產(chǎn)物分離純化,DHPLC進行DMs雜合/純合樣品檢測驗證④ABI377自動測序儀進行測序分析,將測序結(jié)果以Sequencher 4.90軟件正常人類基因組參照序列進行比對分析。結(jié)果1最終引物序列:DMPK(450bp):Forward primer: 5'-CGA CTC CGG GGC CCC GTT GGA AGA CT-3';Reverse primer: 5'-CTC CCC AGA GCA GGG CGT CAT GCA CAA G-3';ZNF9(295bp):Forward primer: 5'-GGC CTT ATA ACC ATG CAA AT-3';Reverse primer: 5'-GCC TAG GGG ACA AA GTGAGA-3';2優(yōu)化傳統(tǒng)PCR反應(yīng)程序:①優(yōu)化DMPK循環(huán)參數(shù):預(yù)變性:95°C,5 min;變性:95°C,45 s;退火:66°C,8 s;延伸:78°C,3min;30個循環(huán);最終延伸:72°C,10 min;②優(yōu)化Znf9循環(huán)參數(shù):預(yù)變性:95°C,5 min;變性:95°C,45 s;退火:65°C,8 s;延伸:75°C,3min;30個循環(huán);最終延伸:72°C,10 min;③循環(huán)體系最終確立:應(yīng)用Dy NAzyme EXT DNA polymerase PCR(Finnzymes,Espoo,Finland)擴增增反應(yīng)試劑盒。配置反應(yīng)體系(25μl):(冰浴操作)10×Optimital Dy Nazyme Ex T buffer 2.5μlDy NAzyme EXT DNA polymerase 1.5 μl10m M d NTP(200 u M) 2 μlPCR Forward Primer(10 p M) 1 μLPCR Reverse Primer(10 p M) 1 μLd H2 O 15 μLc DNA 2.0 μL反應(yīng)體系中不添加任何輔助添加劑。④DHPLC純合/雜合檢測應(yīng)用優(yōu)化PCR對入選42例肌強直綜合征患者進行DMPK片段擴增,DHPLC對擴增產(chǎn)物進行純合/雜合分析,20例患者雜合子樣本除外DM1;22例純合樣本,不能除外DM13基因診斷分型:應(yīng)用優(yōu)化PCR對42例入選樣本進行基因診斷分型,22例DMPK純和樣本;20例DMPK雜合樣本。2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物。正常對照PCR擴增產(chǎn)物450bp,(CTG)n重復(fù)數(shù)約為20。22例患者(CTG)n重復(fù)數(shù)53-683,平均CTG)n重復(fù)序列數(shù)約535。對17例先證者家系成員進行(CTG)n重復(fù)數(shù)檢測,證實5例女性患者的兒子(CTG)n異常擴增,平均(CTG)n重復(fù)數(shù)約520次。1例男性患者母親及小姨(CTG)n重復(fù)序列數(shù)分別為103、180次。優(yōu)化傳統(tǒng)PCR對3例雜合樣本及4例無關(guān)對照個體進行Znf9擴增,2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物。正常對照PCR擴增產(chǎn)物295bp,(CCTG)n重復(fù)數(shù)約為20次。結(jié)果示3例患者(CCTG)n重復(fù)序列數(shù)400-450次,平均(CCTG)n重復(fù)序列數(shù)約416次。17例樣本DMPK及Znf9陰性。結(jié)論1高GC含量樣本在PCR反應(yīng)引物序列設(shè)計時,設(shè)定較高退火溫度(Tm)可有效降低G反應(yīng)能,提高PCR擴增反應(yīng)效率。2高GC含量樣本的PCR反應(yīng)程序設(shè)定,縮短退火時間、提高退火溫度、增加延伸反應(yīng)時間及升高延伸溫度能有效提高擴增效率。3本研究優(yōu)化PCR反應(yīng),建立了高效、經(jīng)濟及簡便DM分子生物學(xué)診斷方法,可應(yīng)用DM的分子生物學(xué)診斷及鑒別診斷,推薦廣泛臨床應(yīng)用。第二部分強直性肌營養(yǎng)不良臨床及骨骼肌病理研究目的:強直性肌營養(yǎng)不良(Myotonic dystrophies,DMs)是一組以肌強直、進行性加重肌無力、肌萎縮等骨骼肌癥狀為主,伴白內(nèi)障、早禿、心律失常、認知和行為異常、內(nèi)分泌、生殖功能等多系統(tǒng)受累的常染色體顯性遺傳(Autosomal dominant,AD)骨骼肌疾病。多青春期后期起病,全球發(fā)病率2.45~5.5/10萬,無明顯地區(qū)及種族差異性。同一家系可有不同臨床表型。電生理檢查呈典型肌強直合并肌病電位,部分患者可合并周圍神經(jīng)受損�；顧z骨骼肌示典型肌源性改變,可見典型核內(nèi)移、核聚集、肌漿塊等結(jié)構(gòu)改變。根據(jù)臨床表型、致病基因分DM1及DM2兩亞型,DM1四肢遠端肌肌強直、肌無力、肌萎縮;DM2又稱近端型強直性肌營養(yǎng)不良(Proximal myotonic myopathy),臨床癥狀與DM1相似,但以肢體近端肌受累為主。本研究回顧性分析25例臨床、病理及優(yōu)化PCR基因檢測診斷為DMs患者臨床資料,總結(jié)、分析中國DMs臨床表型及骨骼肌病理特點。方法1臨床病例資料收集回顧性總結(jié)分析25例第一部分研究明確診斷證實為DMs患者臨床病例資料。2骨骼肌病理分析全部患者簽署病理診斷及分子生物學(xué)診斷知情同意書。肱二頭肌開放式骨骼肌活檢獲取標(biāo)本(1×0.5 cm),迅速異戊烷/液氮冷凍,13種常規(guī)組織化學(xué)、酶學(xué)染色(蘇木精-伊紅、改良Gomori三原色、還原型輔酶Ⅰ-四氮唑還原酶、琥珀酸脫氫酶、單磷酸腺苷脫氨酶、細胞色素C氧化酶、三磷酸腺苷環(huán)化酶、酸性磷酸酶、過碘酸雪夫氏、油紅O/蘇丹黑B)。結(jié)果1 22例確診DMs基本臨床表現(xiàn):電生理肌強直電位/伴少量肌病電位,美西律、卡馬西平聯(lián)合治療肌強直癥狀顯著改善。22例DM1,9例男性,13例女性,四肢遠端肌起病肌無力、肌萎縮(動作笨拙緩慢僵硬),叩擊性肌球(+),17/22 DM1不同程度伴心臟病(束支傳導(dǎo)阻滯為主)、白內(nèi)障(7)、甲狀腺(1)、內(nèi)分泌(1)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累(6);3例DM2四肢近端肌無力起病,肌球(+),臨床癥狀輕,3例伴不同程度心臟功能異常,余系統(tǒng)受累(-)。2骨骼肌病理:肌源性改變,散在肌纖維變性、壞死、再生,結(jié)締組織輕至中度增生;可見中心核、核內(nèi)移、肌漿塊、核聚集;部分肌纖維酶活性局灶降低,可見蟲噬樣肌纖維、環(huán)狀肌纖維。DM1小角化散在;DM1Ⅱ型肌纖維優(yōu)勢、群化,DM2Ⅰ型肌纖維優(yōu)勢。結(jié)論1中國人群DMs中DM1發(fā)病率顯著高于DM2,臨床表現(xiàn)典型肌強直伴肌無力、肌肉萎縮,伴多系統(tǒng)受累“綜合臨床表型”,與既往DMs臨床表型報道無顯著差異。2 DMs骨骼肌病理分析出現(xiàn)上述典型病理表現(xiàn)可提示診斷DMs,DM1Ⅱ型肌纖維優(yōu)勢、群化,DM2Ⅰ型肌纖維優(yōu)勢。3 DM1臨床及骨骼肌受累程度與(CTG)n呈正相關(guān),核苷酸重復(fù)序列數(shù)目越多,臨床表型越重,起病越早;DM2與發(fā)病年齡及病程呈正相關(guān)。第三部分非萎縮性肌強直臨床及分子生物學(xué)研究目的:先天性肌強直(Myotonia Congenita,MC)及先天性副肌強直(Paramyotonia Congenita,PC)是NDMs重要亞型。與DMs相鑒別的是其由分布在骨骼肌細胞膜離子通道亞單位編碼基因直接變異引起離子通道功能改變的一組先天性骨骼肌離子通道病。MC由位于7q35CLCN-1變異致病,經(jīng)典MC除肌強直癥狀外,多伴肌容飽滿,叩擊性“肌球”,握拳伸直困難,“加溫”現(xiàn)象,少數(shù)患者伴肌肉疼痛。根據(jù)遺傳方式分為AD遺傳—Thomsen's肌強直(DMC)及AR遺傳—Becker’s肌強直(RMC)。PC由位于17q23.1-25.3編碼Na+通道的SCN4A發(fā)生變異致病。PC主要表現(xiàn)突發(fā)性、遇冷誘發(fā)肌強直、力弱;運動后肌強直癥狀加重。該亞型舌面肌、上肢遠端肌群較下肢受累顯著,且肌強直較力弱持續(xù)時間短。目前,該組疾病尚缺乏典型骨骼肌病理形態(tài)及生化檢測改變,多通過臨床表型、電生理檢查與其它亞型肌強直骨骼肌遺疾病鑒別。豐富的臨床/遺傳異質(zhì)性為其診斷、分型、治療、預(yù)后及預(yù)防提出了難題。本研究對入選17例NDMs(包括5例先證者家系成員)進行臨床、骨骼肌病理分析研究,并應(yīng)用分子生物學(xué)方法明確診斷分型,初步探討該組疾病在中國人群發(fā)病及基因變異特點。方法1病例篩選選取第一部分研究中17例DMs篩查陰性患者列入組研究。歸納整理17例入組病例臨床資料,包括:性別、發(fā)病年齡、家族史(遺傳方式)、叩擊性“肌球”(±)、握拳伸直(±)、“加溫”現(xiàn)象(±)、肌力、肌容受累肌群、跟腱攣縮(±)、其它系統(tǒng)受累情況、肌酸激酶(CK)、電生理檢查、治療情況等。2活檢骨骼肌病理分析,同第一部分。3 基因檢測應(yīng)用Primer 5軟件進行PCR反應(yīng)引物設(shè)計,覆蓋CLCN-1、SCN4A、KCNE3、CACNA1S基因全長,包括23個外顯子、24個外顯子、3個外顯子、44個外顯子及內(nèi)含子交界區(qū)。進行相關(guān)致病基因變異位點檢測。結(jié)果1研究基因分析CLCN-1檢測陽性率47%(8/17),新發(fā)7個致病基因位點集中分布在8、12號外顯子區(qū)域;SCN4A檢測陽性率29%(4/17),新發(fā)3個致病位點集中分布在22、24號外顯子區(qū)域。根據(jù)基因分型臨床診斷:8例先證者明確診斷MC(1例DMC);4例先證者明確診斷PC;MC發(fā)病人群顯著高于PC。2 NDMs多5-10歲起病,臨床以肌強直為主癥,電生理呈肌強直電位,極少伴肌病電位,患者有繼發(fā)跟腱攣縮、脊柱側(cè)彎現(xiàn)象,部分伴心功能異常。給予卡馬西平及美西律聯(lián)合治療肌強直癥狀可得到顯著緩解。3 17例NDMs活檢骨骼肌肌源性改變,未發(fā)現(xiàn)特異性病理結(jié)構(gòu)改變,部分重癥患者可見肌細胞變性、壞死、再生,酶活性局灶降低,散在小角化肌纖維(Ⅰ型為主)。9例MC出現(xiàn)ⅡB肌纖維缺如,該特點可用于MC及PMC鑒別診斷。與DMs相區(qū)別:NDMs無特異性結(jié)構(gòu)改變及活躍肌纖維變性、壞死、結(jié)締組織重度增生等強直性肌營養(yǎng)不良病理改變,提示活檢骨骼肌病理分析有助于強直性肌營養(yǎng)不良與非萎縮性肌強直鑒別診斷,但并能作為該組疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)論1基因檢測分析是NDMs診斷及分型診斷的金標(biāo)準(zhǔn);NDMs涉及致病基因多,二代測序技術(shù)的推廣能更好用于該組疾病的診斷與分型診斷。2中國人群存在新發(fā)CLCN-1/SCN4A致病突變位點,上述致病位點目前尚無數(shù)據(jù)庫報道,擴大了上述基因致病譜。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R746
，

本文編號：2321093