發(fā)布時(shí)間：2018-11-09 15:12

【摘要】：研究目的： 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元�。∕otor Neuron Disease，MND）是一組由運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元慢性進(jìn)行性變性導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是臨床常見病，發(fā)病率較高的MND主要有肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）、進(jìn)行性脊髓性肌萎縮（progressiveSpinal Muscular atrophy，pSMA）、進(jìn)行性延髓性麻痹（Progressive bulbar palsy，PBP）及原發(fā)性側(cè)索硬化（Primary Lateral Sclerosis，PLS）等，臨床缺乏有效的治療手段，而干細(xì)胞的移植治療是目前的研究熱點(diǎn)。而干細(xì)胞移植治療MND所涉及的一系列問題如干細(xì)胞的來源、干細(xì)胞向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元誘導(dǎo)分化的方法及干細(xì)胞源性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在體內(nèi)的功能和穩(wěn)定性等，都沒有得到很好的解決。因此，對(duì)這些問題進(jìn)行深入的研究、評(píng)估其可行性將具有重要的理論價(jià)值和實(shí)際意義。 毛囊神經(jīng)嵴干細(xì)胞（hair follicle neural crest stem cells，hfNCSCs）廣泛存在于毛囊隆突部，屬于神經(jīng)嵴來源干細(xì)胞，在自然分化條件下可分化為神經(jīng)細(xì)胞。在我們實(shí)驗(yàn)室前期工作中已成功將hfNCSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，并觀測(cè)到hfNCSCs源性神經(jīng)元樣細(xì)胞可以移植修復(fù)周圍神經(jīng)不同距離的缺損。鑒于hfNCSCs具有可來源于自體、易于獲取、活性好、體內(nèi)成瘤的幾率較低等優(yōu)點(diǎn)，值得作為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的來源干細(xì)胞進(jìn)行深入的研究和探討。 目前對(duì)于干細(xì)胞向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的誘導(dǎo)分化已進(jìn)行了較為廣泛的探索，研究中所涉及的誘導(dǎo)物質(zhì)和方法，如維甲酸（Retinoic Acid，RA）和音猬因子（Sonic hedgehog，Shh）、曲古柳菌素（Trichostatin A，TSA）、8-Br-cAMP、咯利普蘭（Rolipram，Rp）以及RG108等各有優(yōu)缺點(diǎn)，尚無一種理想的誘導(dǎo)分化方案。 為解決運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的來源問題，本研究擬以大鼠hfNCSCs為種子細(xì)胞，應(yīng)用RA、Shh聯(lián)合TSA、8-Br-cAMP、Rp、RG108，誘導(dǎo)hfNCSCs向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分化，研究誘導(dǎo)分化細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，特異性基因、蛋白的表達(dá)以及在體內(nèi)的穩(wěn)定性和能否行使運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的功能，以探討干細(xì)胞源性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的可行性。 研究方法： ⑴大鼠hfNCSCs的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增及鑒定：采用組織貼塊法分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增大鼠hfNCSCs，并檢測(cè)Nestin（神經(jīng)干細(xì)胞表面標(biāo)記）、Sox10（神經(jīng)嵴來源干細(xì)胞標(biāo)記）的表達(dá)。 ⑵大鼠hfNCSCs向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的誘導(dǎo)分化：將擴(kuò)增后的hfNCSCs應(yīng)用RA、Shh聯(lián)合小分子化合物如8-Br-cAMP、Rp、TSA、RG108等進(jìn)行誘導(dǎo)分化，并對(duì)誘導(dǎo)后細(xì)胞檢測(cè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元標(biāo)記β-Tubulin Ⅲ、MAP2、ChAT、HB9、Olig2及Islet-1等的表達(dá)。 ⑶大鼠hfNCSCs源性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞體內(nèi)功能和穩(wěn)定性檢測(cè)：構(gòu)建大鼠坐骨神經(jīng)損傷動(dòng)物模型并根據(jù)分組情況進(jìn)行細(xì)胞移植，大鼠hfNCSCs源性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞移植組（簡(jiǎn)稱誘導(dǎo)細(xì)胞組，注射大鼠hfNCSCs源性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞），大鼠hfNCSCs組（注射hfNCSCs）和PBS組（注射無菌PBS），分別于術(shù)后2w、4w、8w和12w檢測(cè)記錄各組動(dòng)物的試驗(yàn)情況，對(duì)坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度、坐骨神經(jīng)髓鞘厚度、腓腸肌濕重進(jìn)行檢測(cè)并分析。 結(jié)果： ⑴經(jīng)過組織貼塊法分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增得到的大鼠hfNCSCs活性好、增殖速度快、細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、大小一致，且純度較高，約有97.78%的細(xì)胞Nestin+、92.67%的細(xì)胞Sox10+。 ⑵經(jīng)過RA、Shh與8-Br-cAMP、TSA、Rp、RG108等的聯(lián)合誘導(dǎo)分化，大鼠hfNCSCs呈多突起的神經(jīng)元樣形態(tài)，免疫熒光化學(xué)結(jié)果顯示運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元特異性標(biāo)記如HB9、ChAT、Islet-1、Olig2等均有陽性表達(dá)，且基因、蛋白水平也有表達(dá)，約有50%的大鼠hfNCSCs誘導(dǎo)分化為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞。 ⑶大鼠hfNCSCs源性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞可以在坐骨神經(jīng)內(nèi)存活、增殖，，并維持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的功能與特性。 結(jié)論： ⑴hfNCSCs可作為臨床移植運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的來源干細(xì)胞； ⑵RA、Shh聯(lián)合8-Br-cAMP、TSA、Rp、RG108可有效促進(jìn)大鼠hfNCSCs向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分化。 ⑶大鼠hfNCSCs源性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞在周圍神經(jīng)內(nèi)可以存活、增殖，并可維持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的功能與特性。
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【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R741

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉芳;許家軍;張傳森;黨瑞山;陳爾瑜;;成年大鼠毛囊神經(jīng)嵴干細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定及初步誘導(dǎo)分化[J];解剖學(xué)雜志;2006年05期

本文編號(hào)：2320774