【摘要】：研究目的： 運動神經(jīng)元�。∕otor Neuron Disease，MND）是一組由運動神經(jīng)元慢性進行性變性導致的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是臨床常見病，發(fā)病率較高的MND主要有肌萎縮性脊髓側索硬化癥（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）、進行性脊髓性肌萎縮（progressiveSpinal Muscular atrophy，pSMA）、進行性延髓性麻痹（Progressive bulbar palsy，PBP）及原發(fā)性側索硬化（Primary Lateral Sclerosis，PLS）等，臨床缺乏有效的治療手段，而干細胞的移植治療是目前的研究熱點。而干細胞移植治療MND所涉及的一系列問題如干細胞的來源、干細胞向運動神經(jīng)元誘導分化的方法及干細胞源性運動神經(jīng)元在體內的功能和穩(wěn)定性等，都沒有得到很好的解決。因此，對這些問題進行深入的研究、評估其可行性將具有重要的理論價值和實際意義。 毛囊神經(jīng)嵴干細胞（hair follicle neural crest stem cells，hfNCSCs）廣泛存在于毛囊隆突部，屬于神經(jīng)嵴來源干細胞，在自然分化條件下可分化為神經(jīng)細胞。在我們實驗室前期工作中已成功將hfNCSCs誘導分化為神經(jīng)元樣細胞，并觀測到hfNCSCs源性神經(jīng)元樣細胞可以移植修復周圍神經(jīng)不同距離的缺損。鑒于hfNCSCs具有可來源于自體、易于獲取、活性好、體內成瘤的幾率較低等優(yōu)點，值得作為運動神經(jīng)元的來源干細胞進行深入的研究和探討。 目前對于干細胞向運動神經(jīng)元的誘導分化已進行了較為廣泛的探索，研究中所涉及的誘導物質和方法，如維甲酸（Retinoic Acid，RA）和音猬因子（Sonic hedgehog，Shh）、曲古柳菌素（Trichostatin A，TSA）、8-Br-cAMP、咯利普蘭（Rolipram，Rp）以及RG108等各有優(yōu)缺點，尚無一種理想的誘導分化方案。 為解決運動神經(jīng)元的來源問題，本研究擬以大鼠hfNCSCs為種子細胞，應用RA、Shh聯(lián)合TSA、8-Br-cAMP、Rp、RG108，誘導hfNCSCs向運動神經(jīng)元分化，研究誘導分化細胞的形態(tài)結構變化，特異性基因、蛋白的表達以及在體內的穩(wěn)定性和能否行使運動神經(jīng)元的功能，以探討干細胞源性運動神經(jīng)元移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的可行性。 研究方法： ⑴大鼠hfNCSCs的分離、培養(yǎng)、擴增及鑒定：采用組織貼塊法分離、培養(yǎng)、擴增大鼠hfNCSCs，并檢測Nestin（神經(jīng)干細胞表面標記）、Sox10（神經(jīng)嵴來源干細胞標記）的表達。 ⑵大鼠hfNCSCs向運動神經(jīng)元的誘導分化：將擴增后的hfNCSCs應用RA、Shh聯(lián)合小分子化合物如8-Br-cAMP、Rp、TSA、RG108等進行誘導分化，并對誘導后細胞檢測運動神經(jīng)元標記β-Tubulin Ⅲ、MAP2、ChAT、HB9、Olig2及Islet-1等的表達。 ⑶大鼠hfNCSCs源性運動神經(jīng)元樣細胞體內功能和穩(wěn)定性檢測：構建大鼠坐骨神經(jīng)損傷動物模型并根據(jù)分組情況進行細胞移植，大鼠hfNCSCs源性運動神經(jīng)元樣細胞移植組（簡稱誘導細胞組，注射大鼠hfNCSCs源性運動神經(jīng)元樣細胞），大鼠hfNCSCs組（注射hfNCSCs）和PBS組（注射無菌PBS），分別于術后2w、4w、8w和12w檢測記錄各組動物的試驗情況，對坐骨神經(jīng)傳導速度、坐骨神經(jīng)髓鞘厚度、腓腸肌濕重進行檢測并分析。 結果： ⑴經(jīng)過組織貼塊法分離、培養(yǎng)、擴增得到的大鼠hfNCSCs活性好、增殖速度快、細胞形態(tài)規(guī)則、大小一致，且純度較高，約有97.78%的細胞Nestin+、92.67%的細胞Sox10+。 ⑵經(jīng)過RA、Shh與8-Br-cAMP、TSA、Rp、RG108等的聯(lián)合誘導分化，大鼠hfNCSCs呈多突起的神經(jīng)元樣形態(tài)，免疫熒光化學結果顯示運動神經(jīng)元特異性標記如HB9、ChAT、Islet-1、Olig2等均有陽性表達，且基因、蛋白水平也有表達，約有50%的大鼠hfNCSCs誘導分化為運動神經(jīng)元樣細胞。 ⑶大鼠hfNCSCs源性運動神經(jīng)元樣細胞可以在坐骨神經(jīng)內存活、增殖，，并維持運動神經(jīng)元的功能與特性。 結論： ⑴hfNCSCs可作為臨床移植運動神經(jīng)元的來源干細胞； ⑵RA、Shh聯(lián)合8-Br-cAMP、TSA、Rp、RG108可有效促進大鼠hfNCSCs向運動神經(jīng)元分化。 ⑶大鼠hfNCSCs源性運動神經(jīng)元樣細胞在周圍神經(jīng)內可以存活、增殖，并可維持運動神經(jīng)元的功能與特性。
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【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R741

【參考文獻】

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1 劉芳;許家軍;張傳森;黨瑞山;陳爾瑜;;成年大鼠毛囊神經(jīng)嵴干細胞的培養(yǎng)、鑒定及初步誘導分化[J];解剖學雜志;2006年05期

本文編號：2320774