發(fā)布時間：2018-11-07 11:44

【摘要】：背景及目的急性缺血性腦卒中患者除了超早期靜脈溶栓或動脈血管機械開通術(shù)可以恢復(fù)腦血流，避免腦梗死形成，保留神經(jīng)功能。但多數(shù)缺血性腦卒中患者發(fā)展成為腦梗死，并且遺留神經(jīng)功能障礙。缺血性腦卒中患者死亡的主要原因是腦水腫，多數(shù)缺血性腦卒中患者以抗腦水腫治療，促進中樞神經(jīng)軸突再生、神經(jīng)功能恢復(fù)為該疾病主要干預(yù)手段。因為治療腦水腫方法有限，神經(jīng)元周圍軸突再生抑制分子導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生困難，目前缺血性腦卒中治療方法有限。細胞外基質(zhì)蛋白參與形成基底膜，調(diào)控腦組織內(nèi)水平衡，細胞外基質(zhì)蛋白和軸突再生抑制分子關(guān)系密切，對軸突再生抑制分子的信號傳導(dǎo)可能有調(diào)控作用。Fibulin-5是一種細胞外基質(zhì)糖蛋白，既有細胞外基質(zhì)蛋白的作用，又有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的作用。胚胎期Fibulin-5在神經(jīng)管中表達豐富，發(fā)育成熟后神經(jīng)系統(tǒng)Fibulin-5表達降低，疾病狀態(tài)表達再度增高。Fibulin-5是血管再生拮抗劑，穩(wěn)定基底膜，抑制血管出芽，抑制基質(zhì)金屬酶的產(chǎn)生，抑制內(nèi)皮細胞間緊密連接的破壞。Fibulin-5通過RGD序列和纖連蛋白競爭性結(jié)合神經(jīng)元上的整合素α5β1，過表達Fibulin-5和整合素α5β3、α5β5、α9β1結(jié)合，抑制活性氧的產(chǎn)生，增強神經(jīng)細胞抗氧化應(yīng)激的能力，耐缺血抗凋亡的能力等。缺氧刺激時Fibulin-5mRNA水平增高與Akt/mTOR信號通路密切相關(guān)。過表達Fibulin-5可能會激活A(yù)kt，p-Akt水平增高可以激活其下游信號分子GSK-3(糖原合成激酶-3)。磷酸化GSK-3可以促進微管的裝配和軸突的延伸，磷酸化GSK-3可以促進缺血損傷后軸突再生。Fibulin-5廣泛分布在神經(jīng)元周圍的細胞外間質(zhì)中，參與基底膜的形成，且可能與神經(jīng)軸突發(fā)育和損傷修復(fù)密切相關(guān)，目前未見此類研究的報道。本研究擬構(gòu)建Fibulin-5過表達載體重組腺病毒Ad-Fbln-5，腦內(nèi)皮質(zhì)和海馬注射轉(zhuǎn)染大鼠，7天后制作腦缺血再灌注模型，探討Fibulin-5過表達干預(yù)對局灶性腦缺血/再灌注損傷腦水腫的影響，F(xiàn)ibulin-5過表達是否通過抑制AQP4蛋白表達，減輕腦水腫，，縮小腦梗死體積；探討Fibulin-5過表達干預(yù)對局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠的神經(jīng)軸突再生，神經(jīng)功能恢復(fù)的影響；Fibulin-5過表達是否增加腦缺血損傷大鼠神經(jīng)元內(nèi)磷酸化Akt、磷酸化GSK-3水平，抑制缺血損傷后神經(jīng)細胞凋亡，促進GAP43蛋白表達，促進軸突再生和神經(jīng)功能恢復(fù)。 方法 第一部分 1.首先制作過表達載體重組腺病毒Ad-Fbln-5，30只SD大鼠，隨機分為生理鹽水注射組（NS組）、腺病毒Ad-Fbln-5干預(yù)組（Ad-Fbln-5組）和空載體腺病毒Ad-HK干預(yù)組，腦皮質(zhì)和海馬注射確定病毒轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染所用的病毒量。熒光顯微鏡檢測明確重組腺病毒Ad-Fbln-5可以轉(zhuǎn)染大鼠腦皮質(zhì)和海馬，轉(zhuǎn)染所需的病毒滴度為9.5×1010pfu/ml，病毒滴度篩選及毒力測定見課題組程創(chuàng)的碩士論文。熒光定量PCR檢測腺病毒Ad-Fbln-5轉(zhuǎn)染大鼠后Fibulin-5mRNA水平。 2.將216只成年雄性SD大鼠隨機分5組，包括假手術(shù)組（Sham組），Ad-Fbln-5轉(zhuǎn)染后假手術(shù)組（Ad-Fbln-5+Sham組），MCAO/再灌注組(I/R組)，重組腺病毒Ad-Fbln-5干預(yù)組（Ad-Fbln-5+I/R組），空載體重組腺病毒Ad-HK對照組（Ad+I/R組）。MCAO/再灌注組觀察6個時間點，共72只大鼠，其余各組36只。轉(zhuǎn)染病毒7天后，大鼠大腦中動脈被線栓阻塞，2h后拔出線栓恢復(fù)血流灌注，制作局灶性腦缺血/再灌注模型。采用干濕重法檢測各組大鼠缺血損傷后3天時腦組織水含量，采用TTC染色檢測3天時腦梗死體積。 3.熒光定量PCR檢測腦缺血損傷后1天、3天時缺血灶周圍腦組織AQp4mRNA水平，Western blot檢測腦缺血損傷后3天時缺血灶周圍腦組織AQP4蛋白表達，腦缺血損傷后1天時缺血灶周圍腦組織VEGFα、MMP9蛋白表達。 4.免疫熒光雙標記檢測各組大鼠腦缺血損傷后3天時，缺血灶周圍腦組織AQP4在星形膠質(zhì)細胞表達變化；免疫組化檢測缺血損傷后1天、7天時缺血灶周圍腦組織VEGFα的表達變化，進一步比較過表達Fibulin-5干預(yù)對VEGFα的表達影響。 第二部分 1.雄性SD大鼠168只，腦皮質(zhì)和海馬注射重組腺病毒Ad-Fbln-5或空載體重組腺病毒Ad-HK轉(zhuǎn)染后7天，制作MCAO/再灌注模型，分組同前。Western blot檢測腦缺血損傷后Fibulin-5、GAP43、p-AKT、AKT、p-GSK-3β、GSK-3β蛋白表達變化。腦缺血損傷后3天，各組Fibulin-5、p-AKT、p-GSK-3β，GAP43蛋白表達比較。Tunel法檢測腦缺血損傷后3天凋亡細胞，明確Fibulin-5和缺血后神經(jīng)細胞凋亡關(guān)系。 2.熒光定量PCR檢測各組腦缺血損傷后3天，7天時缺血灶周圍腦組織、缺血對側(cè)半球?qū)?yīng)部位腦組織GAP43mRNA水平比較。 3.免疫熒光雙標記檢測Fibulin-5和MAP2，動態(tài)觀察腦缺血損傷后Fibulin-5在神經(jīng)元的表達變化；免疫熒光雙標記動態(tài)觀察Fibulin-5和GAP43表達變化，及過表達Fibulin-5干預(yù)對腦缺血損傷后GAP43表達的影響；免疫熒光雙標記動態(tài)觀察p-GSK-3β和GAP43表達之間的關(guān)系，F(xiàn)ibulin-5過表達干預(yù)對腦缺血損傷后p-GSK-3β和GAP43表達變化的影響。 4.神經(jīng)示蹤劑BDA標記神經(jīng)軸突，腦缺血損傷后7周，過表達Fibulin-5干預(yù)對由缺血對側(cè)大腦皮層傳出神經(jīng)纖維發(fā)出側(cè)枝纖維的影響，紅核平面?zhèn)戎w維跨過中線到缺血側(cè)紅核的神經(jīng)纖維數(shù)進行比較，確定過表達Fibulin-5對缺血損傷后神經(jīng)軸突再生的影響。 5.腦缺血再灌注損傷后1天，3天，7天，2周，4周，采用改良神經(jīng)功能評分標準(modified Neurological Severity Scores; mNSS scores)對各組大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分，比較過表達Fibulin-5干預(yù)對腦缺血損傷后大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。 結(jié)果 第一部分 1.重組腺病毒Ad-Fbln-5轉(zhuǎn)染大鼠后，病毒注射側(cè)（右側(cè)）大腦中動脈供血區(qū)腦組織Fibulin-5mRNA水平是生理鹽水注射組的50倍；腺病毒Ad-Fbln-5干預(yù)組腦缺血再灌注后3天缺血側(cè)腦組織水含量，腦梗死體積都明顯低于MCAO/再灌注組和空病毒Ad對照組（P＜0.05）； 2.缺血性腦損傷后1天、3天，腺病毒Ad-Fbln-5干預(yù)組缺血灶周圍腦組織AQP4mRNA水平顯著低于MCAO/再灌注組和空病毒Ad對照組；腦缺血再灌注后3天，腺病毒Ad-Fbln-5干預(yù)組缺血灶周圍腦組織AQP4蛋白表達水平低于MCAO/再灌注組和空病毒Ad對照組，有顯著性差異（P＜0.05）； 3.腦缺血再灌注后3天，腺病毒Ad-Fbln-5干預(yù)組星形膠質(zhì)細胞AQP4表達低于MCAO/再灌注組和空病毒Ad對照組（P＜0.05）；缺血性腦損傷后1天，腺病毒Ad-Fbln-5干預(yù)組缺血灶周圍腦組織VEGFα、MMP9蛋白表達低于MCAO/再灌注組和空病毒Ad對照組（P＜0.05）；腦缺血損傷后7天，腺病毒Ad-Fbln-5干預(yù)組缺血灶周圍VEGFα表達和MCAO/再灌注組、空病毒Ad對照組間無明顯差別。 第二部分 1.腦缺血損傷后缺血灶周圍腦組織Fibulin-5蛋白表達逐漸增高，缺血損傷后3天Fibulin-5表達水平最高，且Fibulin-5在神經(jīng)元胞體及其周圍表達，星形膠質(zhì)細胞及其周圍未見表達；腦缺血損傷后7天，缺血灶周圍腦組織表達Fibulin-5的神經(jīng)元，GAP43表達也明顯增多，缺血損傷后7天缺血灶周圍腦組織Fibulin-5和GAP43共同表達較明顯，且腺病毒Ad-Fbln-5干預(yù)組缺血灶周圍腦組織Fibulin-5和GAP43雙染陽性細胞明顯多于MCAO/再灌注組和空病毒Ad對照組，有顯著性差異（P＜0.05）。 2.腦缺血再灌注損傷后，缺血灶周圍腦組織p-AKT、p-GSK-3β、GAP43蛋白表達開始增加，缺血損傷后3天缺血灶周圍腦組織p-AKT、p-GSK-3β蛋白水平最高；腦缺血損傷后7天，缺血灶周圍腦組織GAP43蛋白表達水平最高（P＜0.05）；大鼠缺血性腦損傷后3天，腺病毒Ad-Fbln-5干預(yù)組缺血灶周圍腦組織p-AKT、p-GSK-3β和GAP43蛋白表達均高于MCAO/再灌注組和空病毒Ad對照組；腦缺血損傷后7天，腺病毒Ad-Fbln-5干預(yù)組缺血灶周圍腦組織GAP43蛋白表達高于MCAO/再灌注組和空病毒Ad對照組。腦缺血損傷后3天，腺病毒Ad-Fbln-5干預(yù)組缺血灶周圍腦組織凋亡細胞數(shù)顯著少于MCAO/再灌注組和空病毒Ad對照組，有顯著性差異（P＜0.05）。 3.腺病毒Ad-Fbln-5干預(yù)組缺血灶周圍腦組織GAP43mRNA水平在腦缺血損傷后3天明顯高于MCAO/再灌注組和空病毒Ad對照組（P＜0.05）；同時腺病毒Ad-Fbln-5干預(yù)組缺血對側(cè)對應(yīng)區(qū)域腦組織GAP43mRNA高于MCAO/再灌注組和空病毒Ad對照組。缺血性腦損傷后7天時各組間GAP43mRNA水平差異和3天時一樣，腺病毒Ad-Fbln-5干預(yù)組缺血灶周圍腦組織GAP43mRNA明顯高于MCAO/再灌注組和空病毒Ad對照組，對側(cè)也有相同趨勢。 4.腦缺血損傷后7周，腺病毒Ad-Fbln-5干預(yù)組紅核平面缺血對側(cè)BDA染色的神經(jīng)纖維發(fā)出的側(cè)枝形成密集的纖維網(wǎng)，跨過中線的纖維數(shù)明顯多于MCAO/再灌注組和空病毒Ad對照組，且缺血側(cè)紅核染色較深，表明腺病毒Ad-Fbln-5干預(yù)組缺血對側(cè)皮層發(fā)出側(cè)枝支配患側(cè)紅核的纖維束多于MCAO/再灌注組和空病毒Ad對照組（P＜0.05）。 5.腦缺血損傷后3天時腺病毒Ad-Fbln-5干預(yù)組mNSS評分（7.3±1.70）低于MCAO/再灌注組和空病毒Ad對照組（9.5±1.60和9.10±1.92），有顯著性差異（P＜0.05），缺血后7天到4周腺病毒Ad-Fbln-5干預(yù)組mNSS評分都低于MCAO/再灌注組和空病毒Ad對照組，且差異更加明顯（P＜0.05）。 結(jié)論 1. Fibulin-5過表達干預(yù)可以抑制腦缺血損傷后缺血灶周圍腦組織AQP4蛋白表達，減輕大鼠腦缺血/再灌注損傷后腦水腫程度，縮小腦梗死體積，抑制AQP4蛋白表達可能通過抑制VEGFα、MMP9等蛋白的表達而實現(xiàn)。 2.腦缺血再灌注損傷后Fibulin-5蛋白表達逐漸升高，缺血損傷后3天，缺血灶周圍腦組織Fibulin-5蛋白表達水平最高；Fibulin-5不但在血管組織表達，而且可以表達在神經(jīng)元胞體及其周圍，但本研究僅有組織學(xué)觀察，還需要神經(jīng)元細胞實驗進一步驗證Fibulin-5在神經(jīng)元表達。 3. Fibulin-5可以增加缺血灶周圍神經(jīng)元內(nèi)p-AKt、p-GSK-3β蛋白表達水平，增強神經(jīng)細胞抗凋亡能力，且Fibulin-5可以促進GAP43轉(zhuǎn)錄、表達。 4. Fibulin-5可以促進缺血對側(cè)皮層傳出神經(jīng)纖維發(fā)出側(cè)枝延伸至患側(cè)紅核的纖維束增多，促進軸突再生；Fibulin-5可以促進缺血性腦損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。細胞外基質(zhì)蛋白Fibulin-5可能是新的治療腦缺血損傷的靶蛋白分子。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R743.3

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本文編號：2316264