【摘要】：研究背景： 腦作為人體神經(jīng)系統(tǒng)的高級中樞,在控制人體的感覺、情緒、記憶、運動以及邏輯推理等功能上起到了“中央處理器”的作用。然而隨著社會的發(fā)展,人類正遭受越來越多的與腦有關(guān)的疾病的折磨,例如癲癇、帕金森、阿爾茨海默爾病、精神分裂和抑郁癥等,嚴重威脅著人類的身體健康乃至生命。因此,研究腦中與這些疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)的作用機理,并尋找有效的靶基因或治療方法就變得十分有意義。神經(jīng)營養(yǎng)因子家族是腦內(nèi)廣泛存在的一種蛋白,對于促進細胞分化、神經(jīng)生長和神經(jīng)元的存活,維持正常的腦功能十分重要。而且神經(jīng)營養(yǎng)因子的代謝異常通常也與上述某些疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。其中,腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是目前研究最多的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一。 BDNF是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布最為廣泛的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子,在個體發(fā)育期和成年期都有廣泛的表達。BDNF是一種分泌蛋白,主要是通過與兩種不同的受體：高親和力的酪氨酸激酶受體B (Tropomyosin-related kinase B,TrkB)受體和低親和力的p75受體結(jié)合調(diào)節(jié)神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能。BDNF與TrkB的結(jié)合,可以激活胞內(nèi)MAPK/ERK, PLCy和PI3K三條信號通路,從而對軸突生長、神經(jīng)元存活和分化、突觸可塑性以及學(xué)習和記憶起到積極的調(diào)節(jié)作用。而BDNF與低親和力的p75受體的結(jié)合,通常對神經(jīng)元起到負向調(diào)節(jié)的作用,比如誘導(dǎo)凋亡,引起抑郁癥的神經(jīng)可塑性等。研究表明,BDNF與腦的高級功能學(xué)習記憶密切相關(guān),參與多種學(xué)習記憶的過程,如Morris水迷宮、環(huán)境依賴的恐懼記憶等。此外,BDNF還與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān),某些特定神經(jīng)元BDNF表達的改變將導(dǎo)致不同的疾病,包括抑郁癥、癲癇、阿爾茨海默爾病、精神分裂、亨廷頓以及帕金森病等。這些說明BDNF在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常的生理功能中起著十分重要的作用。 近年來的研究發(fā)現(xiàn),人群中廣泛分布著一種BDNF Va166Met基因單核苷酸多態(tài)性(BDNFMet),使得BDNF前體蛋白第66位的纈氨酸變成了甲硫氨酸,導(dǎo)致活性依賴性的BDNF分泌水平降低。擁有這種基因多態(tài)性的個體相對于正常個體擁有明顯的神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的改變,例如海馬(hippocampus, HPC)容積的萎縮和突觸可塑性的降低等,而且更容易表現(xiàn)出焦慮、抑郁和恐懼記憶障礙等諸多功能上的缺陷。然而,關(guān)于BDNFMet基因多態(tài)性與其他功能(如空間記憶、工作記憶等)之間的關(guān)系以及BDNFMet引起這些結(jié)構(gòu)和功能變化的具體分子機制仍不十分清楚。 BDNF Va166Met轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建為我們提供了良好的實驗?zāi)Ｐ�。本課題以BDNFMet轉(zhuǎn)基因小鼠為模型,通過與野生型(wild type, WT)小鼠相比較,研究基礎(chǔ)狀態(tài)下,BDNFMet變異對小鼠個體行為的影響。然后,通過高通量的基因表達譜芯片技術(shù),篩選出在BDNFMet變異小鼠的背側(cè)海馬、腹內(nèi)側(cè)前額葉(prefrontal cortex, PFC)和杏仁核(amygdala, AMY)腦區(qū)受BDNFMet變異影響表達水平發(fā)生改變的基因和信號通路,從分子水平上進一步闡明BDNFMet變異引起這些變化的機制。此外,通過基因芯片的數(shù)據(jù)分析,我們發(fā)現(xiàn),趨化因子信號CX3CL1/CX3CR1和細胞粘附信號PCDH1在BDNFMet變異小鼠海馬組織內(nèi)的表達水平發(fā)生了顯著性改變,我們對其中所涉及到的功能變化和作用機制進行了更加深入的研究。這些研究不僅有助于加深我們對于BDNF胞內(nèi)和胞外信號的深層次的理解,而且為針對BDNFMet變異導(dǎo)致的功能性障礙的治療提供了新的研究思路。 目的： 1.研究BDNFMet變異對于空間記憶和工作記憶等高級神經(jīng)系統(tǒng)功能的影響； 2.利用基因芯片探討B(tài)DNFMet變異導(dǎo)致腦解剖結(jié)構(gòu)和功能異常的分子機制； 3.研究趨化因子CX3CL1對BDNFMet變異導(dǎo)致的記憶障礙的潛在治療效果： 4.研究細胞粘附分子PCDH1的表達調(diào)控機制及其對突觸可塑性調(diào)控的作用。 方法： 1.Morris水迷宮實驗 Morris水迷宮實驗是測試動物空間學(xué)習記憶能力的一個經(jīng)典的行為學(xué)實驗?zāi)Ｐ?在本實驗中用于檢測BDNFMet變異對小鼠海馬依賴的空間記憶的影響。實驗分為隱蔽平臺訓(xùn)練和空間探索測試兩個階段。在隱蔽平臺實驗中,進行連續(xù)6天的水迷宮獲得訓(xùn)練,以每天小鼠找到平臺所需時間長短來評價小鼠空間記憶的獲得能力。第7天,將平臺取走,進行水迷宮探索測試,記錄1分鐘內(nèi)小鼠在目的象限活動的時間和穿越原平臺象限的次數(shù),作為評價小鼠對空間記憶的保存能力的指標。 2.T迷宮自主交替實驗 T迷宮自主交替實驗是測試小鼠工作性記憶的經(jīng)典模型,在本文中用于檢測BDNFMet變異對小鼠的工作記憶的影響。實驗同樣分為訓(xùn)練和測試兩個階段。在訓(xùn)練階段,小鼠進行連續(xù)3天的自主交替行為訓(xùn)練。每只小鼠每天進行兩個階段的訓(xùn)練,每個階段包括連續(xù)6次的自主交替行為訓(xùn)練。在測試階段。將小鼠放入T迷宮主干壁,記錄小鼠連續(xù)6次離開主干壁進入每個側(cè)壁的次數(shù)。小鼠第一次進入兩側(cè)壁中任何一個側(cè)壁都認為是正確的選擇。在連續(xù)6次的選擇中,小鼠交替進入兩側(cè)壁的次數(shù)除以總的選擇次數(shù)即為小鼠正確選擇的比率,以此作為評價小鼠工作記憶的指標。 3.曠場實驗 本實驗中利用曠場實驗對小鼠的自主運動能力進行測試。曠場實驗中,小鼠可自由活動10分鐘,計算小鼠此時間內(nèi)的運動距離作為評價其自發(fā)活動能力的指標。 4.環(huán)境依賴的條件性恐懼記憶實驗 環(huán)境依賴的條件性恐懼記憶實驗用來測試小鼠建立學(xué)習記憶不悅經(jīng)歷和環(huán)境暗示之間關(guān)聯(lián)的能力。本實驗中建立電擊和環(huán)境偶聯(lián)的條件反射。實驗分為訓(xùn)練和測試兩個階段。訓(xùn)練階段,進行3次的足底電擊和環(huán)境的偶聯(lián)。每次電擊2秒,電流強度0.7毫安,每次電擊之間間隔60秒。小鼠的不動行為定義為除了必須的呼吸運動以外完全的趴在一個位置靜止不動。 訓(xùn)練結(jié)束24小時后對小鼠進行恐懼記憶的測試。將小鼠放入其訓(xùn)練時的恐懼記憶實驗箱,無任何足底電擊情況下使其在實驗箱中自由探索5分鐘,記錄并分析小鼠5分鐘內(nèi)的靜止不動時間,以靜止不動時間的百分比作為評價小鼠環(huán)境依賴的恐懼記憶是否形成的指標。 5.實時定量PCR實驗 基礎(chǔ)狀態(tài)下剝離小鼠的腦區(qū),：提取總RNA,分光光度計記錄OD260/OD280同時經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量合格后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Green熒光標記法實時定量PCR檢測目的基因和內(nèi)參β-actin的mRNA表達水平,2-ΔΔCT方法統(tǒng)計目的基因在不同基因型小鼠各腦區(qū)的表達情況。 6.蛋白印跡實驗 基礎(chǔ)狀態(tài)下剝離BDNF+/Met、BDNFMet/Met和野生型小鼠的腦區(qū),經(jīng)裂解液裂解后提取總的蛋白,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白以及內(nèi)參蛋白,經(jīng)一抗和二抗標記后顯色曝光,通過與內(nèi)參蛋白作比較,檢測目的蛋白的表達水平。 7.腦立體定位埋管和微量注射實驗 將小鼠固定于腦立體定位儀,依據(jù)小鼠腦圖譜選定的坐標,向雙側(cè)海馬埋管至特定位置。待手術(shù)結(jié)束,小鼠恢復(fù)兩周后,進行CX3CL1重組蛋白的定點微量注射,然后觀察(1) CX3CL1對BDNFMet/Met小鼠海馬依賴的空間記憶和恐懼記憶缺陷是否有改善作用；(2) CX3CL1是否能促進BDNFMet/Met小鼠海馬的齒狀回顆粒細胞層新生神經(jīng)元的成熟和存活。 8.溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)腹腔注射和免疫組織化學(xué)染色 腦立體定位埋管手術(shù)兩周之后,對BDNFMet/Met和野生型小鼠腹腔注射50mg/kg的BrdU,連續(xù)注射4天,每天一次。從最后一次腹腔注射BrdU算起,分別從第21天和27天起向海馬腦區(qū)進行CX3CL1的定點微量注射,第28天將小鼠斷頭取腦切片,對背側(cè)海馬齒狀回進行BrdU和NeuN的免疫組織化學(xué)雙重染色,統(tǒng)計共染的細胞數(shù)目,以此觀察CX3CL1是否能促進BDNFMet/Met小鼠齒狀回新生神經(jīng)元的成熟和存活。 9.表達譜芯片雜交和數(shù)據(jù)分析 本實驗采用Illumina公司的Mouse WG-6v2.0表達譜芯片觀察BDNFMet變異對小鼠各個腦區(qū)基因表達水平的影響。芯片雜交實驗和初步的信號處理工作由上海伯豪生物技術(shù)有限公司,即生物芯片上海國家工程研究中心完成。之后我們進行了后續(xù)的差異基因篩選并通過Gene Ontology和KEGG數(shù)據(jù)庫進行了信號通路的分析。 結(jié)果： 1. BDNFMet基因多態(tài)性的轉(zhuǎn)錄組分析和功能研究 1.1BDNFMet變異導(dǎo)致基因劑量依賴的空間記憶和工作記憶損傷 在水迷宮實驗訓(xùn)練階段,BDNF+/Met小鼠的逃避潛伏期與野生型小鼠相比沒有顯著性差別。而BDNFMet/Met小鼠在訓(xùn)練第5天和第6天的逃避潛伏期相對于野生型小鼠顯著性增加,具有統(tǒng)計學(xué)差異。在探索實驗中,無論是在目的象限停留的時間還是穿越平臺象限的次數(shù),BDNF+/Met小鼠與野生型小鼠相比都有降低的趨勢,但并無統(tǒng)計學(xué)差異。而BDNFMet/Met純合變異小鼠在目的象限的停留時間和穿越平臺象限的次數(shù)與野生型小鼠相比都有顯著性降低。在T迷宮實驗中,BDNFMet/Met純合變異小鼠在T迷宮自主交替實驗中的正確選擇的次數(shù)相對野生型小鼠顯著性降低,而BDNF+/Met雜合小鼠的表現(xiàn)與野生型小鼠相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異。上述結(jié)果說明,BDNFMet變異會導(dǎo)致小鼠基因劑量依賴的空間記憶和工作記憶的損傷。 1.2BDNFMet變異導(dǎo)致腦區(qū)特異性和基因劑量依賴的基因表達譜和信號通路改變 利用Illumina表達譜芯片,通過比較BDNF+/Met、BDNFMet/Met與野生型小鼠海馬、前額葉和杏仁核腦區(qū)中的基因組mRNA表達水平,我們檢測出在BDNF+/Met小鼠的海馬、前額葉和杏仁核腦區(qū)分別有148、116和150個基因的mRNA表達水平發(fā)生了顯著性改變,而在BDNFMet/Met小鼠的海馬、前額葉和杏仁核腦區(qū)則分別有767、449和476個基因的mRNA表達水平發(fā)生了明顯改變。對差異表達的基因進行信號通路分析發(fā)現(xiàn),三個腦區(qū)既存在各自不同的信號通路的變化,又存在共同調(diào)控的信號通路。說明不同腦區(qū)之間既有各自的獨立性,又有相互的聯(lián)系。 1.3BDNFMet變異選擇性降低小鼠背側(cè)海馬中CX3CL1/CX3CR1信號的表達水平 實時定量PCR和Western Blot結(jié)果顯示,與野生型小鼠相比,在BDNFMet/Met小鼠海馬中,CX3CL1和CX3CR1兩個分子的mRNA和蛋白表達水平顯著降低。而在前額葉和杏仁核腦區(qū),以上兩種分子的mRNA表達水平在BDNpMet/Met小鼠和野生型小鼠之間并沒有明顯差別。 1.4CX3CL1定點微量注射可以糾正BDNFMet/Met小鼠海馬依賴的學(xué)習記憶缺陷 向BDNpMet/Met小鼠海馬腦區(qū)長期定點微量注射重組的CX3CL1蛋白后,分別在環(huán)境依賴的恐懼記憶實驗和水迷宮實驗中檢測CX3CL1對BDNpMet/Met小鼠學(xué)習記憶的影響。結(jié)果顯示,CX3CL1使得BDNFMet/Met小鼠在恐懼記憶測試階段的不動時間顯著增加。在水迷宮實驗中,CX3CL1能明顯增加BDNFMet/Met小鼠在目的象限的時間和穿越平臺的次數(shù)。以上結(jié)果說明,CX3CL1能對BDNFMet/Met小鼠海馬依賴的學(xué)習記憶缺陷起到改善作用。 1.5CX3CL1能促進BDNFMet/Met小鼠海馬齒狀回新生神經(jīng)元的成熟和存活 BDNFMet/Met小鼠海馬齒狀回新生神經(jīng)元的存活率相對于野生型小鼠明顯降低。然而,向BDNFMet/Met小鼠海馬齒狀回部位長期定點微量注射CX3CL1能顯著增加BrdU和NeuN共染的細胞數(shù)目,說明CX3CL1能夠顯著促進BDNFMet/Met小鼠齒狀回新生神經(jīng)元的成熟和存活。這些存活下來新生的神經(jīng)元就有可能整合到了海馬的神經(jīng)環(huán)路當中,從而對學(xué)習記憶起到了改善作用。 2. PCDH1參與介導(dǎo)BDNFMet變異導(dǎo)致的突觸可塑性障礙機制的研究 2.1PCDH1在BDNFMet/Met小鼠海馬腦區(qū)中的表達水平顯著性降低 實時定量PCR和蛋白印跡結(jié)果顯示,與野生型小鼠相比,BDNFMet/Met小鼠海馬腦區(qū)中PCDH1基因的mRNA和蛋白的表達水平都顯著性降低。而與PCDH1同家族的且在海馬腦區(qū)高表達的分子,如PCDH7、PCDH8、PCDH9、 PCDH10、PCDH17、PCDH19和PCDH20等,在BDNFMet/Met和野生型小鼠海馬腦區(qū)中的mRNA表達水平并無顯著性差別。除此之外,SynCAM1、SALM3、 Nectin3、Cdh2、Nlgn1以及NCAM1等在突觸形成和可塑性調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用的突觸細胞粘附分子在BDNFMet/Met和野生型小鼠海馬腦區(qū)中的mRNA表達水平也沒有顯著性差別。 2.2PCDH1在出生后小鼠腦發(fā)育過程中和成年期小鼠腦內(nèi)廣泛性的表達 在出生后小鼠腦發(fā)育過程中,PCDH1蛋白表達水平逐漸提高,并且與突觸后蛋白PSD95有著相似的表達模式。在剛出生的P0天,PCDH1在腦內(nèi)有著相對較低的表達,而在第7天其表達水平則有顯著性的增加,并在第21天達到一個表達的高峰值,并在成年期一直維持著較高的表達水平。此外,在成年小鼠腦內(nèi),PCDH1蛋白廣泛性的表達于不同腦核團,如海馬、前額葉、杏仁核、紋狀體以及內(nèi)嗅皮層等腦區(qū)都有較高的表達,而在下丘腦和小腦中的表達水平則相對較低。 結(jié)論： 本實驗主要有以下幾個發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)新點： 1. BDNFMet/Met純合變異會導(dǎo)致小鼠空間和工作記憶的損傷,而雜合的BDNF+/Met變異對上述記憶的影響不甚明顯。 2.這是我們首次通過基因表達譜芯片研究BDNFMet變異引起海馬、前額葉和杏仁核腦區(qū)結(jié)構(gòu)和功能改變的分子機制,對于深入理解BDNFMet變異的作用機理具有深遠意義。 3. CX3CL1/CX3CR1信號通路異常可能是BDNFMet變異誘發(fā)海馬學(xué)習記憶障礙的原因之一,且外源性的給予CX3CL1能促進BDNFMet/met小鼠海馬齒狀回新生神經(jīng)元的成熟存活,進而對學(xué)習記憶起到改善作用。 4.粘附分子PCDH1在腦內(nèi)廣泛表達,并且受BDNFMet變異影響,PCDH1在小鼠海馬腦區(qū)中表達水平顯著降低,并可能影響突觸的形成。 意義： 我們的研究對于進一步深入的理解BDNFMet變異引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能改變的機制,探討新的針對BDNFMet變異所誘發(fā)的功能障礙的治療方式具有重要的指導(dǎo)意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R741

【共引文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 孫妍,曹玉文,陸天才,潘曉琳,李鋒,蘇拉,蔣金芳,常彬;宮頸上皮癌變過程中細胞分化的研究[J];癌癥;2005年10期

2 劉素秀,劉國棟,張宇;整合素信號系統(tǒng)與創(chuàng)傷愈合[J];創(chuàng)傷外科雜志;2004年06期

3 付中森;朱玉婷;胡濤;;成牙本質(zhì)細胞特異分子標志物的研究進展[J];國際口腔醫(yī)學(xué)雜志;2008年02期

4 廖品琥,曾愛屏;整合素和急性肺損傷[J];國外醫(yī)學(xué).麻醉學(xué)與復(fù)蘇分冊;2003年04期

5 石宇良;曾泉;龍表利;向庭秀;洪蘇玲;胡國華;;PCDH8基因表達對鼻咽癌細胞生物學(xué)效應(yīng)的影響[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2013年14期

6 鄭蕾;王藝明;;帕羅西汀治療抑郁癥后血清神經(jīng)營養(yǎng)因子3的變化[J];貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2013年04期

7 鄭蕾;王藝明;;抑郁癥患者血清IFN-γ、IL-10水平與NGF、NT-3的相關(guān)研究[J];貴州醫(yī)藥;2013年07期

8 齊紅梅;劉微娜;季瀏;;運動抗抑郁的神經(jīng)生物學(xué)機制綜述[J];首都體育學(xué)院學(xué)報;2013年05期

9 杜美蓉;李大金;唐傳玲;;環(huán)孢素A對滋養(yǎng)細胞生物學(xué)行為的良性調(diào)節(jié)作用[J];國際生殖健康/計劃生育雜志;2013年06期

10 肖玲;舒暢;唐記華;王曉萍;王高華;;不同時程的慢性不可預(yù)計溫和應(yīng)激對大鼠海馬神經(jīng)可塑性相關(guān)蛋白水平的影響[J];神經(jīng)損傷與功能重建;2013年06期

相關(guān)會議論文 前1條

1 郝丕達;孫保亮;;PDE4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機制的研究進展[A];中國微循環(huán)學(xué)會2014年全國學(xué)術(shù)會議大會匯編[C];2014年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 白津;JWA通過整合素信號通路調(diào)節(jié)黑色素瘤轉(zhuǎn)移的分子機制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2010年

2 紀鵬;人類ZO-1蛋白第二個PDZ結(jié)構(gòu)域的溶液結(jié)構(gòu)與功能[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2010年

3 紀鐵鳳;整合素α_vβ_3介導(dǎo)的~(99m)Tc-3PRGD_2在乳腺腫瘤中的實驗研究[D];吉林大學(xué);2011年

4 張金平;αv和β_1整合素通過FAK信號通路介導(dǎo)了Aβ對海馬神經(jīng)元的神經(jīng)毒性作用[D];華中科技大學(xué);2011年

5 農(nóng)魯明;周期性機械應(yīng)力下大鼠軟骨細胞面積擴增和遷移部分通過Src-PLCγ1-ERK1/2信號通路[D];南京醫(yī)科大學(xué);2011年

6 張金平;αν和β1整合素通過FAK信號通路介導(dǎo)了Aβ對海馬神經(jīng)元的神經(jīng)毒性作用[D];華中科技大學(xué);2011年

7 許楚甌;腎小管上皮細胞中Cdc42相關(guān)蛋白4對E-cadherin和Occludin表達的影響及調(diào)節(jié)[D];華中科技大學(xué);2012年

8 張惠靜;周期性機械拉伸下人肺上皮細胞生物學(xué)效應(yīng)的研究[D];重慶大學(xué);2002年

9 龐勇;大鼠海馬與嗎啡依賴記憶相關(guān)差異表達基因cDNA的克隆、鑒定及應(yīng)用研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2003年

10 邸玉君;肝癌相關(guān)基因ALC1和HCAP1生物學(xué)功能的初步研究[D];復(fù)旦大學(xué);2003年

，

本文編號：2315739