【摘要】：研究目的 帕金森�。≒arkinson’s disease, PD)是由于黑質(zhì)部位大量的多巴胺神經(jīng)元丟失與死亡引起的中樞神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)生機(jī)制是基礎(chǔ)和臨床面臨的重要問題。近年研究發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的神經(jīng)營養(yǎng)素（neurotrophins, NT）前體分子參與腦發(fā)育、腦損傷過程，例如，神經(jīng)生長因子前體（pro-nerve growth factor, proNGF）能夠與其受體p75NTR和sortilin高親和力結(jié)合，啟動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞凋亡程序引起神經(jīng)元的凋亡發(fā)生，proNGF在這個(gè)過程中發(fā)揮著重要的作用。 研究表明，在黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元發(fā)育、生存和功能活動(dòng)中，膠質(zhì)細(xì)胞同樣發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。其中，膠質(zhì)細(xì)胞能夠產(chǎn)生合成多種神經(jīng)營養(yǎng)素和前體分子，膠質(zhì)細(xì)胞異常活化及其產(chǎn)生的神經(jīng)營養(yǎng)素前體如proNGF是否具有生物活性和疾病意義，是有待闡明的重要問題。本課題擬著重研究小膠質(zhì)細(xì)胞被LPS激活后proNGF是否合成和釋放到細(xì)胞外、是否具有細(xì)胞生物效應(yīng)功能、通過什么信號(hào)途徑誘導(dǎo)多巴胺神經(jīng)元凋亡或死亡等問題，分析神經(jīng)炎癥反應(yīng)中小膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)揮細(xì)胞毒性作用的新途徑，為深入理解活化膠質(zhì)細(xì)胞及其異常釋放proNGF、參與帕金森病病理發(fā)展機(jī)制、以及探索新的疾病干預(yù)治療策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究方法 1）采用大鼠黑質(zhì)內(nèi)立體定位注射LPS方法，建立炎性反應(yīng)的動(dòng)物模型。 2）通過免疫組織化學(xué)、雙標(biāo)記、激光共聚焦顯微鏡觀察方法，研究proNGF、CD11b、Iba1在黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元及小膠質(zhì)細(xì)胞的定位表達(dá)與變化。 3）通過N9、BV2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法，檢測proNGF、proBDNF、proGDNF、MMP-9細(xì)胞定位及蛋白表達(dá)水平與變化情況。 4）通過Western-blot方法分析SH-SY5Y細(xì)胞proNGF、p75NTR、sortilin表達(dá)情況。 5）采用TUNEL、Hoechst/PI、CCK-8等方法，顯示分析SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。 6）采用細(xì)胞信號(hào)檢測方法，分析JNK、JUN信號(hào)參與細(xì)胞凋亡機(jī)制問題。 主要結(jié)果 1.發(fā)現(xiàn)LPS刺激N9/BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的功能活化、proNGF蛋白分子的表達(dá)上調(diào)和細(xì)胞外釋放發(fā)生 1）建立N9/BV2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系、LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)細(xì)胞模型，，證明LPS刺激N9、BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的Iba1陽性表達(dá)上調(diào)、阿米巴樣形態(tài)變化和功能活化。 2）通過免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot方法，發(fā)現(xiàn)LPS能夠刺激N9、BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的proNGF表達(dá)顯著上調(diào)。 3）通過Western blot檢測方法，發(fā)現(xiàn)LPS刺激能夠誘導(dǎo)N9小膠質(zhì)細(xì)胞的proNGF向細(xì)胞外釋放。 2.外源性給予重組proNGF能夠誘導(dǎo)SH-SY5Y多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，表明proNGF具備細(xì)胞生物效應(yīng) 1）建立SH-SY5Y多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)體系，用于神經(jīng)細(xì)胞毒性效應(yīng)檢測。 2）通過TUNEL、Hoechst/PI、caspase3檢測方法，發(fā)現(xiàn)給予外源性重組proNGF（rhproNGF）能夠誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡或死亡，但對(duì)細(xì)胞活力沒有顯著影響。 3）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明LPS能夠刺激黑質(zhì)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和proNGF表達(dá)上調(diào)，并伴有多巴胺神經(jīng)元的變性，提示其參與疾病狀態(tài)下的神經(jīng)炎癥過程。 3. proNGF誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞JNK、c-jun表達(dá)和磷酸化水平升高，表明JNK/c-jun信號(hào)激活可能參與proNGF生物效應(yīng)過程 1）采用SH-SY5Y培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)給予外源性重組proNGF能夠誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的JNK、c-jun表達(dá)上調(diào)和磷酸化水平提高，提示JNK-c-jun信號(hào)的激活參與proNGF的生物效應(yīng)過程。 2）采用細(xì)胞信號(hào)通路抑制劑干預(yù)實(shí)驗(yàn)，初步分析LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化proNGF合成、及其proNGF誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制，通過LPS組、LPS+IWR1（Wnt信號(hào)通路抑制劑）組、LPS+GSI（Notch信號(hào)通路抑制劑）組和對(duì)照組等比較分析，初步提示W(wǎng)nt和Notch信號(hào)通路與激活可能參與小膠質(zhì)細(xì)胞活化和proNGF產(chǎn)生過程，但其確切機(jī)制有待深入的研究闡明。 初步結(jié)論與意義 本研究的主要發(fā)現(xiàn)是LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化并上調(diào)合成和釋放proNGF、并能激活JNK-JUN信號(hào)途徑、誘導(dǎo)多巴胺神經(jīng)細(xì)胞的凋亡發(fā)生，該結(jié)果為深入理解小膠質(zhì)細(xì)胞參與神經(jīng)炎癥反應(yīng)或細(xì)胞毒性效應(yīng)、以及參與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，具有一定的理論和潛在應(yīng)用意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R742.5

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2314528