【摘要】：研究目的 帕金森病（Parkinson’s disease, PD)是由于黑質(zhì)部位大量的多巴胺神經(jīng)元丟失與死亡引起的中樞神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)生機制是基礎(chǔ)和臨床面臨的重要問題。近年研究發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的神經(jīng)營養(yǎng)素（neurotrophins, NT）前體分子參與腦發(fā)育、腦損傷過程，例如，神經(jīng)生長因子前體（pro-nerve growth factor, proNGF）能夠與其受體p75NTR和sortilin高親和力結(jié)合，啟動神經(jīng)細(xì)胞凋亡程序引起神經(jīng)元的凋亡發(fā)生，proNGF在這個過程中發(fā)揮著重要的作用。 研究表明，在黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元發(fā)育、生存和功能活動中，膠質(zhì)細(xì)胞同樣發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。其中，膠質(zhì)細(xì)胞能夠產(chǎn)生合成多種神經(jīng)營養(yǎng)素和前體分子，膠質(zhì)細(xì)胞異�；罨捌洚a(chǎn)生的神經(jīng)營養(yǎng)素前體如proNGF是否具有生物活性和疾病意義，是有待闡明的重要問題。本課題擬著重研究小膠質(zhì)細(xì)胞被LPS激活后proNGF是否合成和釋放到細(xì)胞外、是否具有細(xì)胞生物效應(yīng)功能、通過什么信號途徑誘導(dǎo)多巴胺神經(jīng)元凋亡或死亡等問題，分析神經(jīng)炎癥反應(yīng)中小膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)揮細(xì)胞毒性作用的新途徑，為深入理解活化膠質(zhì)細(xì)胞及其異常釋放proNGF、參與帕金森病病理發(fā)展機制、以及探索新的疾病干預(yù)治療策略提供實驗依據(jù)。 研究方法 1）采用大鼠黑質(zhì)內(nèi)立體定位注射LPS方法，建立炎性反應(yīng)的動物模型。 2）通過免疫組織化學(xué)、雙標(biāo)記、激光共聚焦顯微鏡觀察方法，研究proNGF、CD11b、Iba1在黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元及小膠質(zhì)細(xì)胞的定位表達與變化。 3）通過N9、BV2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法，檢測proNGF、proBDNF、proGDNF、MMP-9細(xì)胞定位及蛋白表達水平與變化情況。 4）通過Western-blot方法分析SH-SY5Y細(xì)胞proNGF、p75NTR、sortilin表達情況。 5）采用TUNEL、Hoechst/PI、CCK-8等方法，顯示分析SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。 6）采用細(xì)胞信號檢測方法，分析JNK、JUN信號參與細(xì)胞凋亡機制問題。 主要結(jié)果 1.發(fā)現(xiàn)LPS刺激N9/BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的功能活化、proNGF蛋白分子的表達上調(diào)和細(xì)胞外釋放發(fā)生 1）建立N9/BV2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系、LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)細(xì)胞模型，，證明LPS刺激N9、BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的Iba1陽性表達上調(diào)、阿米巴樣形態(tài)變化和功能活化。 2）通過免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot方法，發(fā)現(xiàn)LPS能夠刺激N9、BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的proNGF表達顯著上調(diào)。 3）通過Western blot檢測方法，發(fā)現(xiàn)LPS刺激能夠誘導(dǎo)N9小膠質(zhì)細(xì)胞的proNGF向細(xì)胞外釋放。 2.外源性給予重組proNGF能夠誘導(dǎo)SH-SY5Y多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，表明proNGF具備細(xì)胞生物效應(yīng) 1）建立SH-SY5Y多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)體系，用于神經(jīng)細(xì)胞毒性效應(yīng)檢測。 2）通過TUNEL、Hoechst/PI、caspase3檢測方法，發(fā)現(xiàn)給予外源性重組proNGF（rhproNGF）能夠誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡或死亡，但對細(xì)胞活力沒有顯著影響。 3）動物實驗證明LPS能夠刺激黑質(zhì)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和proNGF表達上調(diào)，并伴有多巴胺神經(jīng)元的變性，提示其參與疾病狀態(tài)下的神經(jīng)炎癥過程。 3. proNGF誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞JNK、c-jun表達和磷酸化水平升高，表明JNK/c-jun信號激活可能參與proNGF生物效應(yīng)過程 1）采用SH-SY5Y培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)給予外源性重組proNGF能夠誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的JNK、c-jun表達上調(diào)和磷酸化水平提高，提示JNK-c-jun信號的激活參與proNGF的生物效應(yīng)過程。 2）采用細(xì)胞信號通路抑制劑干預(yù)實驗，初步分析LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化proNGF合成、及其proNGF誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的可能機制，通過LPS組、LPS+IWR1（Wnt信號通路抑制劑）組、LPS+GSI（Notch信號通路抑制劑）組和對照組等比較分析，初步提示W(wǎng)nt和Notch信號通路與激活可能參與小膠質(zhì)細(xì)胞活化和proNGF產(chǎn)生過程，但其確切機制有待深入的研究闡明。 初步結(jié)論與意義 本研究的主要發(fā)現(xiàn)是LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化并上調(diào)合成和釋放proNGF、并能激活JNK-JUN信號途徑、誘導(dǎo)多巴胺神經(jīng)細(xì)胞的凋亡發(fā)生，該結(jié)果為深入理解小膠質(zhì)細(xì)胞參與神經(jīng)炎癥反應(yīng)或細(xì)胞毒性效應(yīng)、以及參與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展機制提供了新的實驗證據(jù)，具有一定的理論和潛在應(yīng)用意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R742.5

【共引文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳甲;矯樹生;梁春榮;王延江;許志強;;腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子前體對小鼠海馬神經(jīng)元存活和突起生長的抑制作用[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2014年09期

2 李瑩;杜旭飛;杜久林;;小膠質(zhì)細(xì)胞的生理特性和功能[J];生理學(xué)報;2013年05期

3 Shengzhong Ma;Changliang Peng;Shiqing Wu;Dongjin Wu;Chunzheng Gao;;Sciatic nerve regeneration using a nerve growth factor-containing fibrin glue membrane[J];Neural Regeneration Research;2013年36期

4 趙宇鵬;王清秀;;術(shù)后認(rèn)知功能障礙的研究進展[J];同濟大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2014年05期

5 陳衍晨;趙丹;卿娣;程東良;毛姣玉;王斌;;缺氧再灌注斑馬魚胚胎腦部細(xì)胞凋亡及c-fos基因的表達[J];中國組織工程研究;2013年37期

6 楊迪亞;卿國平;王寧利;;青光眼視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞易損性與神經(jīng)營養(yǎng)因子及其前體的相關(guān)性研究進展[J];中華眼科醫(yī)學(xué)雜志(電子版);2012年01期

7 安吉洋;周麗麗;宋錦寧;羅顯華;程毛鋒;孫鵬;龐宏剛;;AMPK介導(dǎo)上調(diào)Bim在大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期皮層神經(jīng)元凋亡中的作用[J];西安交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2013年06期

8 陳江君;劉寧;陳軍;;紅景天對大鼠腦缺血再灌注c-Fos表達及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響[J];中國康復(fù)理論與實踐;2014年03期

9 Xiao-Qing Yang;Yun-Fei Xu;Sen Guo;Yi Liu;Shang-Lei Ning;Xiao-Fei Lu;Hui Yang;Yu-Xin Chen;;Clinical significance of nerve growth factor and tropomyosin-receptor-kinase signaling pathway in intrahepatic cholangiocarcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2014年14期

10 陳雪;李海平;張培;曹安民;;小膠質(zhì)細(xì)胞在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的活化及分布研究[J];眼科新進展;2014年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 鄒蘇琪;成年斑馬魚視神經(jīng)損傷后軸突再生與髓鞘再建的研究[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2013年

2 金文杰;米諾環(huán)素對70%肝切除小鼠術(shù)后遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶能力的影響及機制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2013年

3 孫瑾;白藜蘆醇甙對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠ERK通路的影響及其改善學(xué)習(xí)記憶能力的機制研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2012年

4 王書平;黑腹果蠅對甲醇的解毒代謝及行為反應(yīng)[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

5 張琳;神經(jīng)退行性疾病病理及潛在治療藥物研究[D];中南大學(xué);2013年

6 孟慶慧;Aβ誘導(dǎo)AD大鼠的炎癥機制及乙酰葛根素和殼聚糖磷脂酰膽堿的干預(yù)作用[D];山東大學(xué);2013年

7 Elkhalifa Mahjoub Elkhalifa Ahmed;植入羊膜上皮細(xì)胞的化學(xué)去細(xì)胞肌肉組織工程支架對大鼠脊髓損傷的修復(fù)機制[D];吉林大學(xué);2013年

8 李婷;小鼠急性缺血性腦中風(fēng)后小膠質(zhì)細(xì)胞增生來源的研究[D];蘭州大學(xué);2013年

9 王勇;NGF及其受體對卵泡發(fā)育調(diào)控的分子機制研究[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2013年

10 穆原;miR-206-3p在小鼠皮膚發(fā)育中的作用探討[D];江蘇大學(xué);2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張惠莉;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植改善慢性腦缺血大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力并影響B(tài)DNF及P75NTR表達[D];鄭州大學(xué);2013年

2 楊穎珂;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對腦出血大鼠血腫周圍凋亡及P75NTR、TrkA表達的影響[D];鄭州大學(xué);2013年

3 夏天光;抑郁癥患者血清腦源性神經(jīng)生長因子、皮質(zhì)醇及其比值的變化和臨床意義[D];河北醫(yī)科大學(xué);2013年

4 衣洋;阿托伐他汀預(yù)處理對SD大鼠局部腦缺血再灌注損傷后IL-6、IL-1β、c-fos表達的影響[D];大連醫(yī)科大學(xué);2012年

5 李紅梅;人類膜蛋白p75NTR/BNIP3L與p75NTR/BFAR相互作用及其生物學(xué)功能的初步研究[D];復(fù)旦大學(xué);2011年

6 何艷艷;BDNF對小腦間位核投射神經(jīng)元GABA能神經(jīng)傳遞的調(diào)控及其受體機制的研究[D];南京大學(xué);2013年

7 滕鵬;枸杞多糖對細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的抗炎癥作用[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2013年

8 楊彬;福爾馬林誘導(dǎo)的炎性痛中外周proBDNF的表達變化及作用[D];中南大學(xué);2013年

9 陳琛;中藥液對麻黃素成癮小鼠大腦皮層組織結(jié)構(gòu)及相關(guān)活性物質(zhì)的影響[D];西北師范大學(xué);2013年

10 郭巍燕;幾種有毒揮發(fā)物對黑腹果蠅趨化和趨邊行為的影響[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

本文編號：2314528