【摘要】：周圍神經(jīng)損傷是臨床上的常見病、多發(fā)病，也是疑難病，其難點是損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)欠佳甚至不恢復(fù)，這與神經(jīng)損傷的程度、部位、性質(zhì)、手術(shù)修復(fù)的方法與時機、術(shù)者手術(shù)技巧及病人的整體狀況等諸多因素有關(guān)。臨床上判斷神經(jīng)功能恢復(fù)及軸突再生水平通常采用肌力測定、感覺功能檢查、肌電圖、Tinel征等方法，但這些方法缺乏時效性且判斷結(jié)果受主觀因素影響不夠準(zhǔn)確也不直觀。因此，探索神經(jīng)損傷修復(fù)后能夠早期、客觀、準(zhǔn)確地評價神經(jīng)再生水平的檢測方法，對于判斷神經(jīng)修復(fù)效果及功能轉(zhuǎn)歸至關(guān)重要。神經(jīng)示蹤技術(shù)是神經(jīng)解剖學(xué)和神經(jīng)再生研究中最常用的方法之一，較神經(jīng)電生理和行為學(xué)檢查可更直觀地評價神經(jīng)再生水平，并能反映神經(jīng)功能恢復(fù)的程度。傳統(tǒng)神經(jīng)示蹤劑包括辣根過氧化物酶、生物素葡聚糖胺、親神經(jīng)性細(xì)菌毒素、有機熒光染料等都存在各自缺點，如復(fù)雜的操作過程、費時的免疫組化染色、熒光信號弱以及易光漂白等。近年來，熒光納米材料被廣泛應(yīng)用于生物傳感器、細(xì)胞標(biāo)記、活體成像和其他生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中。碳點是一類具有納米尺寸的新型碳基熒光粒子，包括碳納米點、聚合物點和石墨烯量子點，三者具有不同的尺寸、表面電荷和量子產(chǎn)率，因此展現(xiàn)出不同生物學(xué)效應(yīng)。但總體上，他們都具有良好的水溶性、穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)、抗光漂白、易于化學(xué)修飾、激發(fā)依賴性多色發(fā)光，最重要的是，相比于重金屬半導(dǎo)體量子點，碳點具有低毒性和極佳的生物相容性，有較好的臨床應(yīng)用前景。掌握碳點的細(xì)胞攝取機制與細(xì)胞內(nèi)分布情況，評價碳點的動物體內(nèi)毒性，利用碳點獨特的光學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)制備新型熒光納米神經(jīng)示蹤劑，是本論文的三個研究主題。 第一部分是三種熒光碳點的細(xì)胞行為學(xué)研究，是其細(xì)胞水平相關(guān)應(yīng)用的重要基礎(chǔ)。我們以神經(jīng)細(xì)胞為研究對象，包括大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（交感神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞）和大鼠雪旺細(xì)胞（周圍神經(jīng)系統(tǒng)正常神經(jīng)細(xì)胞），總體的研究思路是從碳點的細(xì)胞毒性和細(xì)胞攝取速率入手，先確定細(xì)胞成像所需最適濃度和最佳孵育時間；然后利用不同的內(nèi)吞抑制劑研究碳點的具體細(xì)胞攝取途徑，通過熒光共定位標(biāo)記技術(shù)觀察碳點的細(xì)胞內(nèi)運輸及分布情況；最后分析碳點的細(xì)胞外排作用。實驗結(jié)果表明：（1）較小尺寸（1-5nm）的碳納米點具有極低細(xì)胞毒性，其細(xì)胞攝取速率極高，5min內(nèi)即可進入細(xì)胞且呈劑量、時間和部分能量依賴性，涉及被動擴散作用和胞膜窖、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用；內(nèi)化的碳納米點可通過核孔復(fù)合體擴散進入細(xì)胞核，但大部分是經(jīng)內(nèi)涵體和胞膜窖小體轉(zhuǎn)運至溶酶體和高爾基體，并主動運輸?shù)郊?xì)胞膜周圍通過胞吐作用排出細(xì)胞。（2）較大尺寸（約60nm）的聚合物點的細(xì)胞毒性亦較低，但細(xì)胞攝取速率、途徑及細(xì)胞內(nèi)分布與尺寸較小的碳納米點均不相同；15min后開始進入細(xì)胞，細(xì)胞攝取呈完全能量依賴性，無被動擴散作用，具體機制與胞膜窖介導(dǎo)內(nèi)吞作用有關(guān)；細(xì)胞內(nèi)主要聚集在溶酶體中，少部分分布于線粒體，但不能進入細(xì)胞核；其熒光性質(zhì)較碳納米點和商品化熒光染料均更穩(wěn)定。（3）石墨烯量子點同樣具有低毒性、時間依賴性細(xì)胞攝取、溶酶體集中分布的性質(zhì)，但是我們的研究重點是利用其更長的激發(fā)和發(fā)射波長進行活體成像應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)石墨烯量子點具有較強熒光信號和較高的信噪比。 第二部分是碳點動物體內(nèi)毒性的系統(tǒng)檢測，是其活體成像應(yīng)用的重要前提。與具有重金屬毒性的傳統(tǒng)半導(dǎo)體量子點相比，碳點類材料最吸引人的優(yōu)點是其低毒性和良好的生物相容性，具有臨床應(yīng)用前景。但是有關(guān)碳點低毒性的研究通常指低細(xì)胞毒性，關(guān)于其動物體內(nèi)毒性研究報道較少。我們以Wistar大鼠為模型，選擇尺寸最�。�1-5nm）、量子產(chǎn)率最高（約80%）、細(xì)胞毒性極低的碳納米點為研究對象，檢測其目前報道最高劑量（100mg/kg）時體內(nèi)毒性，包括大鼠體重變化、血清生化學(xué)檢測、全血細(xì)胞計數(shù)以及主要臟器組織學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)碳納米點對大鼠血液系統(tǒng)及主要臟器均無明顯毒性，為進一步神經(jīng)示蹤應(yīng)用提供生物安全性保障。 第三部分是基于碳點的新型熒光納米神經(jīng)示蹤劑的創(chuàng)制，是在掌握了高效發(fā)光碳納米點的物理化學(xué)性質(zhì)、細(xì)胞行為學(xué)和生物安全性的基礎(chǔ)上進行的。將其作為熒光標(biāo)記物，利用無毒性、親神經(jīng)性的霍亂毒素B亞基作為配體解決神經(jīng)特異性；通過偶聯(lián)反應(yīng)合成霍亂毒素B-碳納米點復(fù)合物，將其運用于周圍神經(jīng)示蹤研究中，，發(fā)現(xiàn)它可被神經(jīng)元軸突末梢攝取并逆行運輸至神經(jīng)元胞體，具有較高的熒光強度、良好的光穩(wěn)定性、較長的生物活性以及低毒性。最重要的是這種新型神經(jīng)示蹤劑制作成本低且操作過程簡單、直接、省時、易于掌握。 總之，從三種新型熒光碳點的細(xì)胞行為學(xué)研究中探討納米材料的物理化學(xué)性質(zhì)與生物學(xué)性質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)，到選擇最適碳點進行生物安全性檢測，再到開展新型熒光納米神經(jīng)示蹤劑的創(chuàng)制與應(yīng)用。本論文遵循由淺入深原則進行醫(yī)學(xué)與化學(xué)的跨學(xué)科研究，不僅詳細(xì)闡述碳點的細(xì)胞攝取機制與細(xì)胞內(nèi)分布情況，為其在細(xì)胞水平的相關(guān)應(yīng)用提供理論支持，并對其體內(nèi)毒性進行系統(tǒng)檢測，為活體成像應(yīng)用提供生物安全性保障，而且首次報道了基于碳點的新型熒光納米神經(jīng)示蹤劑的創(chuàng)制，并成功應(yīng)用于周圍神經(jīng)示蹤研究，為新一代熒光納米粒子相關(guān)的神經(jīng)示蹤劑的研發(fā)奠定了實驗基礎(chǔ)，拓展了新思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R745

【共引文獻】

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本文編號：2310628