【摘要】：背景目前認為三磷酸腺苷(Adenosine-5'-triphosphate,ATP)是神經(jīng)系統(tǒng)中重要的信號分子之一,P2X7受體(P2X7R)是介導ATP毒性作用的主要受體,生理濃度(微摩爾水平)下,ATP激活P2X7R形成陽離子通道,可非選擇性地介導Ca~(2+)、Na+內(nèi)流,K+外流等,參與一系列生理作用,如調(diào)節(jié)遞質(zhì)釋放、修飾突觸和營養(yǎng)神經(jīng)等作用[1-3]。然而,胞外高濃度ATP反復刺激P2X7R則可以形成“膜孔”,允許各種陽離子及NMDG+、YO-PRO-1等900D以下的大分子物質(zhì)通過[4,5],產(chǎn)生細胞毒性作用,引起細胞凋亡、壞死。有研究顯示,在腦損傷中,P2X7R過度活化可以增加細胞外Ca~(2+)內(nèi)流,誘發(fā)Ca~(2+)超載[6],加重腦組織損傷,介導神經(jīng)元凋亡和壞死。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性中毒性損傷、創(chuàng)傷性損傷、脊髓損傷、中風等動物實驗中,應用孕酮(Progesterone)療法可延緩模型動物的神經(jīng)細胞壞死和凋亡,減輕炎癥反應以及缺血性腦損傷導致的腦水腫,促進腦神經(jīng)髓鞘的合成,促進血腦屏障重建[7-9],并且能改善與年齡有關的癡呆(阿爾茨海默病)、降低癲癇等神經(jīng)退行性病變的發(fā)生與發(fā)展[10-20]。至今腦損傷治療仍是人類面臨的極大難題,臨床上缺乏理想的干預方法和手段,孕酮或許能為患者帶來一絲希望。既然ATP濃度升高是多種中樞或外周神經(jīng)元繼發(fā)性損傷時的普遍現(xiàn)象,孕酮對神經(jīng)元繼發(fā)性損傷的保護作用也已得到證實。那么,研究孕酮調(diào)控P2X7R膜孔激活就具有特別的理論意義。本實驗試圖通過觀察孕酮對ATP誘導的SH-SY5Y細胞損傷的影響,探討孕酮神經(jīng)元保護作用的機制,為其臨床應用提供實驗依據(jù)。目的觀察高濃度ATP對人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y的影響,探討孕酮抗ATP誘導SH-SY5Y細胞損傷的影響及相關機制。方法1細胞存活率的測定1.1取對數(shù)生長期分化良好的SH-SY5Y細胞,吹打成細胞懸液,以5×l04/m L的細胞密度種置在96孔培養(yǎng)板中,在5%CO2,37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,隨機分為4組:(1)空白組:無細胞,只含培養(yǎng)基。(2)正常對照組:SH-SY5Y細胞常規(guī)培養(yǎng),無ATP處理(0 m M ATP)。(3)ATP組(分別用1、3、5、7 m M ATP)。孵育2 h后,以正常對照組的存活率為100%,CCK-8法檢測該細胞在不同ATP濃度作用下的存活率。1.2 SH-SY5Y細胞實驗處理方法同上,分為6組,正常對照組、ATP組、孕酮(10、30、100、300 n M)+ATP組。孕酮預孵育30 min,然后加入5 m M ATP處理2 h,使孕酮存在于整個反應體系中。以正常對照組的存活率為100%,CCK-8法測各組中的細胞存活率。2檢測SH-SY5Y細胞膜孔形成2.1取對數(shù)生長期分化良好的SH-SY5Y細胞,吹打成細胞懸液后,以5×l04/m L的細胞密度種置于96孔培養(yǎng)板中,隨機分組為:正常對照組、ATP組(l、3、5、7 m M ATP)。ATP作用2h,將YO-PRO-1(2μM)加入該體系中孵育l h,經(jīng)酶標儀檢測各組的熒光強度。2.2取對數(shù)生長期分化良好的SH-SY5Y細胞,以5×l04/m L的細胞密度培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板中,隨機分組為:正常對照組、ATP組、ATP+KN-62(P2X7受體拮抗劑)組、ATP+孕酮組。其ATP為5 m M,孕酮為30 n M,KN-62為500 n M。孕酮或KN-62先孵育30 min后,ATP作用2h,將YO-PRO-1(2μM)加入該體系中孵育l h,經(jīng)酶標儀檢測各組細胞的熒光強度。3 Furo-3/AM檢測細胞內(nèi)游離Ca~(2+)濃度3.1取對數(shù)生長期分化良好的SH-SY5Y細胞,吹打成細胞懸液后,以5×l04/m L的細胞密度種置于96孔培養(yǎng)板中,隨機分為4組:0、1、3、5 m M ATP,各組均分別作用15、30、60 min,Hank’s溶液洗滌3次,加終濃度含5μM Fluo 3-AM和2μM Hoechst 33342的無血清、無酚紅H-DMEM培養(yǎng)液,37℃孵育30 min。熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)熒光發(fā)射強度變化。3.2取對數(shù)生長期分化良好的SH-SY5Y細胞,吹打成細胞懸液后,以5×l04/m L的細胞密度種置于96孔培養(yǎng)板中,隨機分為4組:正常對照組、ATP組、孕酮+ATP組、KN-6~(2+)ATP組。其ATP為5 m M,孕酮為30 n M,KN-62為500 n M。孕酮或KN-62先孵育30 min后,ATP作用2 h,然后Hank’S洗滌細胞3次,加終濃度含5μM Fluo 3-AM和2μM Hoechst 33342的無血清、無酚紅H-DMEM培養(yǎng)液,37℃孵育30min。熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)熒光發(fā)射強度變化。4 SH-SY5Y細胞P2X7受體表達的檢測取對數(shù)生長期分化良好的SH-SY5Y細胞,隨機分成3組:正常對照組、5 m M ATP組、30 n M孕酮+5 m M ATP組。提取細胞膜蛋白,BCA法測定蛋白質(zhì)濃度,Western blotting檢測SH-SY5Y細胞P2X7受體表達水平。結果1 SH-SY5Y細胞存活率的測定1.1不同濃度的ATP作用2 h對SH-SY5Y細胞存活率的影響以正常對照組細胞存活率為100.0%,CCK-8法檢測結果:1、3、5、7 m M ATP組存活率分別為80.4%,71.7%,56.1%,36.2%,與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。隨胞外ATP濃度增高,細胞存活率逐漸降低,呈劑量依賴性。1.2孕酮對ATP誘導的SH-SY5Y細胞存活率的影響以細胞正常對照組存活率為100.0%。ATP組細胞存活率為56.1%。3 n M孕酮+ATP組、10 n M孕酮+ATP組、30 n M孕酮+ATP、100 n M孕酮+ATP組細胞存活率分別為62.8%,64.6%,74.4%,59.7%,與單純ATP組相比均有明顯差異(P0.05)。孕酮在保護ATP誘導的SH-SY5Y細胞的損傷中具有濃度依賴性。2檢測SH-SY5Y細胞膜孔形成2.1 ATP誘導SH-SY5Y細胞膜通透性的變化以胞內(nèi)YO-PRO-1熒光強度為指標,觀察ATP對SH-SY5Y細胞通透性的影響。以對照組YO-PRO-1的熒光強度為100.0%,1、3、5、7 m M ATP組分別是103.5%,108.6%,120.5%,140.6%,與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(*P0.05,**P0.01,***P0.001),且表現(xiàn)出濃度依賴性的特征。2.2孕酮對ATP誘導的SH-SY5Y細胞膜孔形成的影響熒光顯微鏡下觀察胞內(nèi)YO-PRO-1熒光強度,結果,5 m M ATP組明顯強于正常對照組,而孕酮(PROG)+ATP組和KN-6~(2+)ATP組熒光信號明顯低于ATP組。多功能酶標儀檢測也有類似結果,經(jīng)孕酮或KN-62先作用于30 min后,再給予ATP處理2 h,細胞內(nèi)的熒光強度分別為103.9%、98.23%,均明顯低于ATP組120.5%(P0.01),而與正常對照組無顯著差別(P0.05)。3孕酮對細胞內(nèi)游離Ca~(2+)濃度的影響正常SH-SY5Y細胞在不同時間內(nèi)鈣離子含量及分布較穩(wěn)定。隨著ATP組作用的延長,平均熒光值的對數(shù)值逐漸增高,即胞內(nèi)鈣離子逐漸增高。孕酮(PROG)+ATP組和KN-6~(2+)ATP組與ATP組相比較,細胞內(nèi)鈣離子明顯降低(P0.05)。4孕酮對ATP誘導的SH-SY5Y細胞P2X7受體表達的影響5 m M ATP處理2 h后SH-SY5Y細胞P2X7受體蛋白表達明顯增加(P0.05),而預先給予30 n M孕酮(PROG)預孵育30 min后,再加ATP作用2 h,P2X7受體蛋白表達水平則顯著低于ATP處理組(P0.05)。結論KN-62可以降低ATP介導的SH-SY5Y細胞對YO-PRO-1的攝入、胞內(nèi)游離鈣離子的上升、提高細胞存活率,說明P2X7受體在ATP誘導的SH-SY5Y細胞死亡中起著重要作用;孕酮有相似于P2X7受體拮抗劑“KN-62”的作用,能顯著抑制ATP誘導的細胞膜孔形成,降低細胞內(nèi)Ca~(2+)濃度,提高細胞存活率。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R741

【參考文獻】

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本文編號：2282399