【摘要】：SOX (SRY-like HMG box)基因家族編碼了一類具有高度保守HMG (high mobility group)結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子,該家族成員通過識(shí)別特定的DNA序列結(jié)合到基因組上并對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,在真核生物的胚胎發(fā)育等生物過程中發(fā)揮了重要的作用。目前在人類和老鼠的基因組中共發(fā)現(xiàn)了20個(gè)SOX家族成員。SOX4是SOX家族中C亞族的成員之一,該亞族還包括SOX11和SOX12。 SOX4已被證實(shí)對(duì)B細(xì)胞,淋巴細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分化具有促進(jìn)作用并參與調(diào)控了神經(jīng)細(xì)胞的分化。大量研究報(bào)道SOX4在多種腫瘤組織例如腺樣囊性癌、肝腫瘤、膀胱癌、急性粒細(xì)胞白血病、前列腺癌、內(nèi)皮細(xì)胞癌和腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量上調(diào)。 在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育早期SOX4與SOX11對(duì)細(xì)胞的發(fā)育、成熟起著至關(guān)重要的作用。在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中,SOX4受到TGF-beta的調(diào)控,誘導(dǎo)干細(xì)胞標(biāo)志物SOX2的表達(dá),對(duì)維持其腫瘤干細(xì)胞的特性起到了重要的作用。本實(shí)驗(yàn)室成員已對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織進(jìn)行定量PCR和免疫組化分析并證實(shí),SOX4在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的mRNA和蛋白表達(dá)均高于正常腦組織。然而SOX4在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的作用及其分子機(jī)理目前尚無報(bào)道。本人針對(duì)SOX4在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的功能和其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了研究,共分為四個(gè)部分： 首先,我用Real-time PCR方法驗(yàn)證了SOX4基因在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞中高表達(dá),為了研究SOX4對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞功能的影響,我利用RNA干擾技術(shù)抑制SOX4表達(dá)并發(fā)現(xiàn)SOX4表達(dá)降低的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖變快,細(xì)胞連接減弱,細(xì)胞出現(xiàn)分化的趨勢(shì),提示SOX4可能具有抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的功能。 第二部分,我選取膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中SOX4表達(dá)量相對(duì)較低的細(xì)胞系,利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和慢病毒感染的方法分別在細(xì)胞中瞬時(shí)或穩(wěn)定高表達(dá)外源SOX4基因并觀察SOX4對(duì)這些細(xì)胞生物行為學(xué)的影響。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在SOX4基因瞬時(shí)及穩(wěn)定過表達(dá)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中,細(xì)胞的增殖、克隆形成能力均明顯減弱,且細(xì)胞發(fā)生G0/G1細(xì)胞周期阻滯。為了驗(yàn)證SOX4過表達(dá)對(duì)細(xì)胞功能造成以上影響,接下來我利用Cre重組酶將外源的SOX4片段從穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞中敲除,發(fā)現(xiàn)外源SOX4被敲除的細(xì)胞的增殖等功能得到了相應(yīng)的恢復(fù),G0/G1細(xì)胞周期阻滯減少。通過對(duì)p53-p21信號(hào)通路的研究發(fā)現(xiàn)SOX4在細(xì)胞核內(nèi)高表達(dá)的同時(shí)增加了細(xì)胞核內(nèi)p53蛋白的含量,上調(diào)了其下游信號(hào)p21蛋白的表達(dá),促使細(xì)胞進(jìn)入G0/G1細(xì)胞周期阻滯。 第三部分,我利用基因芯片技術(shù)分析了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤LN229細(xì)胞中SOX4基因高表達(dá)所造成的基因表達(dá)譜的改變。用穩(wěn)定高表達(dá)SOX4的LN229細(xì)胞和對(duì)照組LN229細(xì)胞做基因表達(dá)芯片進(jìn)行比較后,我找到了633個(gè)基因受到SOX4調(diào)控后表達(dá)差異大于1.8倍。對(duì)這些基因進(jìn)行功能聚類分析發(fā)現(xiàn),SOX4調(diào)控了包括細(xì)胞周期(cell cycle)、發(fā)育(growth)、染色體相關(guān)(chromosome)、DNA復(fù)制、包裝(DNA replication、packaging)、脂質(zhì)代謝(steroid metabolic)等生物學(xué)過程。其中,我發(fā)現(xiàn)beta-catenin的mRNA水平隨著SOX4的高表達(dá)而上調(diào),并且該變化在蛋白水平也得到了驗(yàn)證。通過細(xì)胞核／細(xì)胞漿蛋白的Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),雖然beta-catenin在細(xì)胞總蛋白中的含量上升,但是細(xì)胞核內(nèi)的beta-catenin并沒有增加,這說明beta-catenin受到SOX4調(diào)控高表達(dá)后未能定位到細(xì)胞核,因此不能與TCF/LEF形成復(fù)合物轉(zhuǎn)錄激活Wnt通路的下游信號(hào),故SOX4高表達(dá)的beta-catenin未能發(fā)揮其促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能。 最后,我利用免疫共沉淀與高通量測(cè)序結(jié)合技術(shù)(ChIP-seq)對(duì)LN229細(xì)胞中SOX4的轉(zhuǎn)錄調(diào)控靶基因進(jìn)行了研究。我找到了437個(gè)受到SOX4轉(zhuǎn)錄調(diào)控的靶基因,與基因芯片的數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn),其中有18個(gè)基因表達(dá)受到SOX4的調(diào)控而改變(變化1.5倍),其中9個(gè)基因的表達(dá)差異大于1.8倍。同時(shí)有44個(gè)基因在前列腺癌中也被發(fā)現(xiàn)是SOX4的靶基因,我通過PCR驗(yàn)證和western blot實(shí)驗(yàn)證明了HDAC9受到SOX4的直接調(diào)控。 總之,本文證明了SOX4在神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中高表達(dá),并且用RNAi將SOX4低表達(dá)后,神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的生長(zhǎng)加快,且細(xì)胞連接緊密程度降低,一些干細(xì)胞narker (如CD44)基因表達(dá)降低,細(xì)胞出現(xiàn)分化的趨勢(shì)。第二,在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中雖然SOX4能夠上調(diào)beta-catenin的表達(dá),但是beta-catenin未能定位到細(xì)胞核內(nèi),不能激活Wnt下游信號(hào),從而不能發(fā)揮其促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能；相反SOX4誘導(dǎo)細(xì)胞核內(nèi)p53蛋白的增加,通過激活p53-p21信號(hào)通路起到抑制癌基因的作用。最后,利用基因芯片和ChIP-seq高通量測(cè)序技術(shù)深入挖掘SOX4在LN229細(xì)胞中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)了SOX4間接以及直接調(diào)控的基因,這些發(fā)現(xiàn)為今后更加全面和深入的探索SOX4在腫瘤中作用的分子機(jī)理提供了研究基礎(chǔ)和線索。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R739.4

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2280493