【摘要】：共濟(jì)失調(diào),是一種神經(jīng)性疾病,其特征是失去平衡和運(yùn)動協(xié)調(diào)能力并經(jīng)常伴隨著神經(jīng)障礙例如步態(tài)不穩(wěn)、測距不準(zhǔn)、協(xié)同不能以及眼球震顫等。共濟(jì)失調(diào)的患者初期表現(xiàn)出來的是笨拙的和不能平穩(wěn)的行走,以及說話含糊不清等特征。最終病人會喪失協(xié)調(diào)的吞咽和呼吸能力,這將會是致命的。許多形式的共濟(jì)失調(diào)能追溯到小腦的缺陷,因為小腦在運(yùn)動協(xié)調(diào)和運(yùn)動精確調(diào)控中起到重要的作用。小腦突觸可塑性的主要產(chǎn)生位點是平行纖維(parallel fiber,PF)—浦肯野細(xì)胞(Purkinje cell,PC)突觸的長時程抑制(long-term depression,LTD),和它相對應(yīng)的,長時程增強(qiáng)(long-term potentiation,LTP)。小腦突觸可塑性的缺陷,比如各種基因敲除或轉(zhuǎn)基因鼠中,都表現(xiàn)出小腦運(yùn)動協(xié)調(diào)和運(yùn)動學(xué)習(xí)等功能的損害。G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptor,GPCR)是一種與三聚體G蛋白偶聯(lián)的細(xì)胞表面受體。是迄今發(fā)現(xiàn)的最大的受體超家族,且分布廣泛,具有重要的生理功能。Lgr4屬于GPCR中富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體家族成員,具有高度的保守性。在人類中幾乎分布于大部分的組織和器官。利用基因敲除小鼠模型,LGR4基因的許多生物學(xué)功能陸續(xù)被報道出來。之前的研究已經(jīng)表明丟失LGR4基因會導(dǎo)致在許多方面的發(fā)育缺陷,包括子宮內(nèi)生長阻滯以及胚胎期和出生后的致死,骨的形成以及重建的功能異常,雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育缺陷,眼前節(jié)發(fā)育不良,腎臟發(fā)育異常,頭發(fā)基板形成受損,以及膽囊和膽囊導(dǎo)管發(fā)育的缺陷等。最近還發(fā)現(xiàn)LGR4基因?qū)π∧c中的潘氏細(xì)胞的分化和維持小腸干細(xì)胞的干細(xì)胞特性有著重要作用。但迄今為止還沒有任何相關(guān)報道顯示LGR4基因在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用。本實驗利用LGR4基因敲除小鼠模型,對LGR4基因在平衡和運(yùn)動協(xié)調(diào),以及小腦中的功能進(jìn)行了一系列的研究。共分為以下三個部分:1.Lgr4基因敲除鼠具有小腦共濟(jì)失調(diào)表型我們對Lgr4基因敲除小鼠進(jìn)行了一系列的動物行為學(xué)分析。首先通過足跡分析實驗,我們發(fā)現(xiàn)Lgr4基因敲除鼠在步態(tài)寬度、交替系數(shù)以及線性運(yùn)動等各項指標(biāo)方面和同窩的野生型小鼠有著顯著性差異。接著在與平衡和運(yùn)動協(xié)調(diào)及運(yùn)動學(xué)習(xí)有關(guān)的測試中,發(fā)現(xiàn)Lgr4基因敲除鼠無論是在轉(zhuǎn)棒實驗還是平衡木實驗測試中,與野生型小鼠相比有顯著性差異。另外,我們發(fā)現(xiàn)Lgr4基因敲除鼠有著正常的其他行為能力,例如基本運(yùn)動能力和抓握能力。2.Lgr4基因敲除鼠的小腦浦肯野細(xì)胞減少通過β-半乳糖苷酶組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn),Lgr4基因是在小鼠的浦肯野細(xì)胞中高表達(dá)。另外通過免疫組織化學(xué)和免疫熒光化學(xué)染色,觀察了不同年齡階段(4周、8周和28周)的野生型和Lgr4基因敲除型鼠的浦肯野細(xì)胞的數(shù)目,以及浦肯野細(xì)胞的形態(tài)。發(fā)現(xiàn)成年的Lgr4基因敲除鼠在各個年齡階段均有明顯的浦肯野細(xì)胞的減少(約20%-30%),且未發(fā)現(xiàn)存活的浦肯野細(xì)胞的形態(tài)與野生型的存在明顯差異。隨后檢測了從出生后第1天到第10天時間內(nèi),兩種基因型的小腦發(fā)育情況以及浦肯野細(xì)胞數(shù)目的對比。發(fā)現(xiàn)出生后的發(fā)育過程中從小腦葉片的發(fā)育到小葉皮層各細(xì)胞層的發(fā)育都無顯著性差異。且β-半乳糖苷酶組織化學(xué)染色顯示,Lgr4基因從出生后第1天開始就在小腦的浦肯野細(xì)胞中有表達(dá)。從出生后第5天開始,Lgr4基因敲除鼠的小腦浦肯野細(xì)胞的數(shù)目明顯的少于野生型鼠,且這種數(shù)目差異一直持續(xù)到第10天。3.Lgr4基因敲除鼠小腦浦肯野細(xì)胞的突觸可塑性受損通過離體腦片的場電位記錄發(fā)現(xiàn),Lgr4基因敲除型鼠的小腦PF-PC的刺激強(qiáng)度-反應(yīng)曲線無明顯改變,但雙脈沖易化反應(yīng)(PPF)與野生型相比有明顯減小。同時發(fā)現(xiàn)CF-PC的基本突觸傳遞無明顯變化。接下來我們發(fā)現(xiàn)Lgr4基因敲除鼠能誘導(dǎo)出的LTD和LTP,但與野生型鼠相比有著明顯的降低。由于各種長時程的神經(jīng)的可塑性都依賴于活性驅(qū)動的基因表達(dá)。通過免疫組織化學(xué)和免疫熒光化學(xué)染色發(fā)現(xiàn),Lgr4基因敲除鼠中只有極少數(shù)的浦肯野細(xì)胞能發(fā)現(xiàn)有磷酸化的CREB的表達(dá),而在野生型鼠中磷酸化的CREB的表達(dá)于幾乎所有的浦肯野細(xì)胞中。且未發(fā)現(xiàn)β-catenin和ERK1/2在兩種基因型鼠的小腦中表達(dá)有任何差別。加入cAMP的激活劑forskolin之后,可以明顯發(fā)現(xiàn)Lgr4基因敲除鼠的浦肯野細(xì)胞中能發(fā)現(xiàn)有大量的磷酸化的CREB的表達(dá)。隨后,利用離體腦片場電位記錄技術(shù),也發(fā)現(xiàn)加入cAMP的激活劑forskolin之后Lgr4基因敲除鼠受損的PF-PC突觸的LTD和LTP都與野生型鼠的類似。綜上所述,本論文第一次發(fā)現(xiàn)了 Lgr4基因在小腦浦肯野細(xì)胞的發(fā)育和小腦的突觸可塑性,以及運(yùn)動協(xié)調(diào)和運(yùn)動學(xué)習(xí)中的重要作用。通過動物行為學(xué)方法首次發(fā)現(xiàn)了 Lgr4基因敲除小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的小腦共濟(jì)失調(diào)表型。接著通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)Lgr4基因特異性的表達(dá)在小腦的浦肯野細(xì)胞中,并發(fā)現(xiàn)敲除鼠的小腦有20-30%左右的浦肯野細(xì)胞的減少。電生理的方法揭示基因敲除鼠中小腦的平行纖維-浦肯野細(xì)胞突觸的LTD和LTP受損。加入cAMP的激活劑forskolin可以重新敲除鼠中失活的CREB并恢復(fù)受損的突觸可塑性。由此推斷Lgr4基因可能通過cAMP-PKA-CREB信號通路影響CREB的活化來參與小腦的突觸可塑性,進(jìn)而影響小腦的平衡和運(yùn)動學(xué)習(xí)能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R744.7

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本文編號：2279766