【摘要】：背景： 多發(fā)性硬化（multiple sclerosis,MS）是一種緩慢進展的中樞神經(jīng)脫髓鞘疾病，其特點是大腦與脊髓內(nèi)播散性脫髓鞘，造成時間、空間多發(fā)的癥狀、體征，且病程常有多次的緩解與復(fù)發(fā)[1]。大劑量糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid,GC）沖擊治療可以緩解本病，但不能根治，且長期使用糖皮質(zhì)激素有引起高血壓、糖尿病、骨質(zhì)疏松等嚴重副作用。國內(nèi)外研究證實MS多發(fā)于女性，且病程的緩解復(fù)發(fā)與雌激素水平密切相關(guān)，補充雌激素可以減少病情的復(fù)發(fā)[2]。但長期大量使用雌激素存在引發(fā)生殖系統(tǒng)腫瘤、腦血栓疾病的風險。因此，本研究選用具有雌激素樣作用的淫羊藿苷（icraiin,ICA）作為治療藥物，通過對實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）模型神經(jīng)損害、病理、激素水平、相關(guān)受體蛋白及mRNA的表達，探討ICA的療效、劑量相關(guān)性及其與雌激素作用途徑的關(guān)系。 目的： 構(gòu)建MS的動物模型--EAE小鼠模型，用雌激素、雌激素拮抗劑及不同劑量的ICA治療EAE小鼠，從臨床癥狀評分、細胞因子水平、組織病理學(xué)改變等方面探討ICA對EAE的治療作用；從分子水平、雌激素受體蛋白及mRNA表達水平等方面分析不同劑量ICA對雌激素受體蛋白及mRNA的影響，在前期研究的基礎(chǔ)上進一步研究ICA的治療作用與雌激素樣作用的相關(guān)性。 方法： 1、用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline,PBS）將髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白多肽（myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG35-55）稀釋成600ug/ml,將MOG35-55稀釋液與等體積的完全佛氏佐劑（complete freud’s adjuvant,CFA）(滅活的結(jié)核分枝桿菌的終濃度為5mg/ml)混合作為抗原乳劑，接種在C57BL/6小鼠脊柱兩側(cè)皮下四個部位，每個部位接種50ul，在免疫后第0及48小時腹腔內(nèi)分別注射500ng百日咳毒素，免疫后第7天加強免疫一次，抗原劑量與第一次相同，誘導(dǎo)MS的小鼠EAE模型。 2、將EAE模型小鼠按神經(jīng)功能評分隨機分成7組，每組6只。分別為；A為雌激素組，給予己烯雌酚0.2mg/kg.d灌胃；B為大劑量ICA組，給予ICA300mg/kg.d灌胃；C為中劑量ICA組，給予ICA150mg/kg.d灌胃；D為小劑量ICA組，給予ICA50mg/kg.d灌胃；E為雌激素拮抗劑ICI182,780組，給予ICA150mg/kg.d灌胃加ICI182,7801mg/mouse.d皮下注射；M為模型對照組，給予等容量0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃；N為正常對照組，給予等容量0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃。小鼠免疫接種后第9天開始陸續(xù)發(fā)病，第14天左右達到發(fā)病高峰期，在免疫第9天每天觀察小鼠神經(jīng)功能評分及體重，按評分情況將小鼠分在各組。在免疫第14天開始連續(xù)給藥，5天后將各組小鼠處死取材，取血及腦、脊髓等組織。 3、取小鼠脊髓腰膨大處進行HE染色，觀察小鼠脫髓鞘情況；將腦組織進行勻漿，提取RNA，用PCR法檢測腦組織中雌激素受體α（estrogen receptor α,ERα）及雌激素受體β(estrogen receptorβ, ERβ)mRNA的含量；將腦組織進行勻漿，提取蛋白質(zhì)，用Western-blot法檢測腦組織中ERα和ERβ蛋白的含量。 4、用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）檢測血清中轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）的含量。并用放射免疫法檢測血清中雌二醇的含量（estradiol）。 5、對藥物治療各組小鼠進行臨床癥狀評分、體重稱量,對細胞因子含量、雌激素含量、ER mRNA表達量等進行綜合分析，研究ICA的雌激素樣作用及對EAE小鼠的治療作用。 結(jié)果： 1、利用MOG35-55乳劑成功建立了EAE小鼠模型，C57BL/6小鼠于免疫后第9天開始發(fā)病，最高神經(jīng)功能評分達5分，發(fā)病期脊髓病理切片示，，脊髓實質(zhì)內(nèi)大量淋巴細胞浸潤，血管周圍最多，呈“袖套樣”改變。正常對照小鼠未見明顯病理改變。 2、雌激素組（A組）、大劑量ICA組（B組）、中劑量ICA組（C組），治療后體重有所增加，但無統(tǒng)計學(xué)意義。小劑量ICA組（D組）體重減輕，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05；中劑量ICA+ICI組（E組）治療后體重減輕，P＞0.05；治療后臨床評分C、D、E各組都有所下降，以C組和D組下降最明顯，F(xiàn)組評分均值保持不變，F(xiàn)組和D組評分比較差異明顯，P＜0.05。模型對照組（M組）癥狀評分升高。 3、內(nèi)源性雌激素水平：和模型對照組比較及ICI組比較，大劑量組ICA組升高明顯，P＜0.05，具有統(tǒng)計學(xué)意義；中劑量組、小劑量組變化有升高，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05；模型對照組與ICI組比較，無明顯差異，而雌激素組有下降。 4、腦組織中ER mRNA表達水平：①ERa：與M(模型對照組)比較，A（雌激素組）和B（大劑量組）明顯升高（P＜0.05），C（中劑量）、D（小劑量組）稍有升高；M（模型對照組）與E組（ICI+中劑量組）無明顯差異。②ERβ：與ICI組及模型組比較，A（雌激素組）及B（大劑量組）升高明顯（P＜0.05），C（中劑量）和D（小劑量組）稍有升高（P＞0.05）， B（模型對照組）與E組（ICI）無明顯差異。 5、腦組織中ER蛋白含量：①ERa：與M(模型對照組)比較，A（雌激素組）和B（大劑量組）明顯升高（P＜0.05），C（中劑量）、D（小劑量組）稍有升高；M（模型對照組）與E組（ICI+中劑量組）無明顯差異。②ERβ：與ICI組及模型組比較，A（雌激素組）及B（大劑量組）升高明顯（P＜0.05），C（中劑量）和D（小劑量組）稍有升高（P＞0.05）， B（模型對照組）與E組（ICI）無明顯差異。 6、TGF-β水平：各組模型鼠血清中TGFβ水平均較正常組低。其中A（雌激素組）及B(大劑量ICA組)與M(模型對照鼠)及ICI組比較，TGFβ水平增高明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；C(中劑量ICA組)、D(小劑量ICA組)與M(模型對照組)比較，TGFβ水平有所增高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，ICI組與模型組無明顯差異。 結(jié)論： 1、ICA對EAE的臨床癥狀、神經(jīng)病理、炎性反應(yīng)具有治療作用。 2、ICA通過促進小鼠內(nèi)源性雌激素及ER增加，與腦中含量更高的ERβ結(jié)合，對EAE的治療具有針對性，具有雌激素樣作用。 3、ICI182,780作為雌激素拮抗劑，ICI對雌激素有拮抗作用，ICI組治療作用減低，表明ICA系通過ER而發(fā)揮治療EAE的作用。
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【學(xué)位授予單位】：廣東藥學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R744.51

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 周莉;樊永平;;多發(fā)性硬化軸索損傷的中西醫(yī)研究進展[J];北京中醫(yī)藥;2009年08期

2 王世平;文娛;張毅;張金娟;;淫羊藿苷的擬雌激素作用研究[J];貴州醫(yī)藥;2010年11期

本文編號：2275728