【摘要】：目的： 在整體及細胞水平研究黃芩苷對缺血性腦神經(jīng)元損傷的保護作用，并探討其激活MRTF-A介導(dǎo)的抗過氧化氫誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元凋亡的機制。 方法： 1.黃芩苷對右側(cè)大腦中動脈栓塞（MCAO）/再灌注損傷大鼠腦神經(jīng)功能、腦梗塞體積的影響：36只雄性成年SD大鼠（250-300g）隨機分成6組：黃芩苷低中高劑量組（50，100和200mg/kg，腹腔注射）、尼莫地平組（陽性對組，0.4mg/kg，腹腔注射）、模型組（等量生理鹽水、腹腔注射）及正常對照組（等量生理鹽水、腹腔注射）。在行MCAO手術(shù)前，按分組要求分別腹腔注射黃芩苷及生理鹽水，連續(xù)給藥3天。3天后，對模型組、黃芩苷高中低劑量組及尼莫地平組大鼠進行MCAO手術(shù)。2小時后，抽出尼龍絲進行24小時再灌注。用Longa法對大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分；取腦組織，用TTC染色評價腦梗塞體積損傷程度；采用Western blot和RT-PCR檢測腦組織中BCL-2及MCL-1表達水平；采用免疫熒光法檢測腦組織中MRTF-A的表達。 2.黃芩苷激活MRTF-A介導(dǎo)抗過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡作用及機制：轉(zhuǎn)染MRTF-AsiRNA至體外培養(yǎng)大鼠原代皮層神經(jīng)元，48小時后，用黃芩苷（0.7μM、1.4μM、2.8μM）干預(yù)神經(jīng)元。24小時后，用H2O2（800μM）處理細胞30min。采用流式細胞術(shù)（FCM）檢測細胞凋亡率，用Western blot和RT-PCR檢測BCL-2及MCL-1表達水平，以此在細胞水平證明黃芩苷抗H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡作用是通過MRTF-A激活BCL-2及MCL-1的表達實現(xiàn)的；在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建啟動子含CArG box的BCL-2-luc及MCL-1-luc及其突變體mut BCL-2-luc及mut MCL-1-luc報告基因質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)大鼠原代皮層神經(jīng)元中，48小時后，用黃芩苷（0.7μM、1.4μM、2.8μM）干預(yù)神經(jīng)元。同樣用H2O2（800μM）處理細胞30min。采用熒光素酶檢測法檢測其活性，以此證明黃芩苷介導(dǎo)MRTF-A的轉(zhuǎn)錄激活作用與MRTF-A作用于BCL-2及MCL-1啟動子上的CArG box有關(guān)。 3.黃芩苷激活MRTF-A介導(dǎo)的抗H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡作用及對BCL-2及MCL-1基因的轉(zhuǎn)錄激活作用可能與其激活PI3K、ERK1/2信號通路有關(guān)：體外培養(yǎng)大鼠原代皮層神經(jīng)元，轉(zhuǎn)染BCL-2-luc及MCL-1-luc及其突變體報告基因質(zhì)粒至皮層神經(jīng)元中，48小時后，用PI3K抑制劑（LY29004）和ERK1/2（PD98059）處理細胞。12小時后，用黃芩苷（0.7μM、1.4μM、2.8μM）干預(yù)細胞。24小時后，用H2O2（800μM）處理細胞30min。采用流式細胞術(shù)（FCM）檢測細胞凋亡率；Western blot檢測MRTF-A表達水平；采用熒光素酶檢測法檢測BCL-2-及MCL-1-luc活性。 結(jié)果： 1.在整體水平證明了黃芩苷能減少MCAO/再灌注引起的大鼠腦組織損傷：大鼠腦MCAO2h再灌注24h后，TTC染色顯示黃芩苷（100和200mg/kg）處理組大鼠腦梗死區(qū)體積分別為20.71±9.79和11.55±5.09mm3，模型組腦梗死區(qū)體積為39.34±7.32mm3，與模型組比較，黃芩苷組腦梗死區(qū)體積明顯減�。╬0.05或p0.01）；Longa法神經(jīng)功能缺損評分顯示：黃芩苷（100和200mg/kg）處理組評分明顯低于模型組（p0.05或p0.01）；Western blot和RT-PCR檢測結(jié)果表明，與模型組相比較，黃芩苷（100和200mg/kg）處理組大鼠腦組織的BCL-2及MCL-1表達水平顯著高于模型組（p0.05或p0.01）；激光共聚焦檢測發(fā)現(xiàn)黃芩苷處理組（100和200mg/kg）大鼠缺血側(cè)腦組織的凋亡細胞明數(shù)明顯少于模型組；免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn)在黃芩苷處理組（100和200mg/kg）的大鼠腦組織中MRTF-A的表達明顯高于模型組，且顯示黃芩苷可能促進了MRTF-A從胞漿向細胞核的轉(zhuǎn)移。 2.在細胞水平證明了黃芩苷抗H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡作用是通過MRTF-A激活BCL-2及MCL-1的轉(zhuǎn)錄表達實現(xiàn)的：黃芩苷（0.7μM、1.4μM、2.8μM）干預(yù)神經(jīng)元24h，H2O2（800μM）處理細胞30min，F(xiàn)CM結(jié)果顯示模型組神經(jīng)細胞凋亡率顯著高于空白對照組，黃芩苷（1.4μM、2.8μM）干預(yù)組的凋亡率明顯下降（p0.05或p0.01），而MRTF-A siRNA組則沒有觀察到此變化；Western blot和RT-PCR顯示BCL-2及MCL-1表達隨黃芩苷濃度（1.4μM、2.8μM）增加而增加（p0.05或p0.01），而MRTF-A siRNA組則沒有觀察到此變化；熒光素酶檢測法檢測到BCL-2-及MCL-1-luc活性隨黃芩苷濃度增加而增強（p0.05或p0.01），而MRTF-A siRNA組則沒有觀察到此變化。 3.在細胞水平證明了黃芩苷激活MRTF-A介導(dǎo)的抗H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡作用及對BCL-2及MCL-1基因的轉(zhuǎn)錄激活作用可能與其激活PI3K、ERK1/2信號通路有關(guān)：FCM結(jié)果顯示模型組神經(jīng)細胞凋亡率顯著高于空白對照組（p0.01）；黃芩苷（1.4μM、2.8μM）干預(yù)組的凋亡率分別為28.0%±2.10和14.1%±1.50，明顯低于模型組（p0.01）；用PI3K抑制劑（LY29004）或ERK1/2（PD98059）干預(yù)后，其凋亡率分別為38.4%±4.33、36.6%±4.10和29.7%±3.95，與對應(yīng)的黃芩苷組比較，其凋亡率明顯升高，與黃芩苷中高劑量對應(yīng)組間比較，具有統(tǒng)計學(xué)差異（p0.05或p0.01）；Western blot顯示：MRTF-A表達隨黃芩苷濃度增加而增加，與模型組比較具有顯著性差異（p0.05或p0.01），而用PI3K抑制劑（LY29004）或ERK1/2（PD98059）干預(yù)后，MRTF-A表達又下降，與黃芩苷中高劑量對應(yīng)組間比較，，具有統(tǒng)計學(xué)差異（p0.05）；熒光素酶檢測法檢測到BCL-2-及MCL-1啟動子轉(zhuǎn)錄活性發(fā)現(xiàn)，PI3K抑制劑（LY29004）或ERK1/2（PD98059）能夠逆轉(zhuǎn)黃芩苷對BCL-2-及MCL-1啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響，與其對應(yīng)劑量組間比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（p0.05或p0.01）。 結(jié)論： 1.在整體動物水平，證明了黃芩苷可以明顯改善MCAO/再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)功能損傷，減少腦梗塞體積，且能增強缺血側(cè)腦組織中MRTF-A的表達及核轉(zhuǎn)移。 2.在細胞水平，證明了黃芩苷抗H2O2誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元凋亡作用是與其激活MRTF-A表達有關(guān)；黃芩苷能通過激活內(nèi)源性MRTF-A表達上調(diào)皮層神經(jīng)元中抗凋亡基因BCL-2及MCL-1的轉(zhuǎn)錄表達，且該作用與MRTF-A激活BCL-2及MCL-1啟動子CArG盒的轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。 3.在細胞水平，證明了黃芩苷抑制H2O2誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元凋亡及激活MRTF-A介導(dǎo)BCL-2和MCL-1表達的上調(diào)可能與PI3K和ERK1/2信號通路相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R741

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Correlation between anti-fibrotic effect of baicalin and serum cytokines in rat hepatic fibrosis[J];World Journal of Gastroenterology;2009年37期

本文編號：2262032