【摘要】：腦卒中是當前威脅人類健康的主要疾病之一。目前腦卒中已躍居為中國的首位死因,其中缺血性腦卒中發(fā)生率占80%-85%。世界衛(wèi)生組織調查結果顯示,目前中國腦血管病發(fā)病率居世界首位,約高于美國1倍。缺血性腦卒中具有發(fā)病率高、致殘率高、復發(fā)率高,治療費用高等特點,在現存的腦卒中患者中,約75%不同程度地喪失了勞動力,40%重度致殘,嚴重影響患者的健康和健康生存質量,給家庭和社會帶來沉重的負擔。腦梗死后繼發(fā)性腦損傷是病情加重的關鍵因素,如何減輕繼發(fā)性腦損傷是臨床面臨的重要課題,其損傷機制復雜,主要涉及興奮性氨基酸毒性、氧化應激損傷、炎癥反應及細胞凋亡等病理過程。目前經臨床證實的唯一有效藥物是重組組織型纖溶酶原激活物(recombinant tissue-type plasminogen activator,rt-PA),但其狹窄的治療時間窗(3-6 h內),和腦缺血再灌注損傷、腦水腫,甚至腦出血等并發(fā)癥,其臨床應用受到限制。因此尋找快速有效的對抗腦卒中的藥物,一直是生命科學研究的熱點和醫(yī)學工作者努力的方向。祖國傳統(tǒng)中草藥具有效果明顯,毒副作用小,也具有多靶點、多方向及多途徑的作用等優(yōu)點。因此,我們從中草藥中篩選具有神經保護作用的藥物。千金藤素(cepharanthine,CEP)是從防己科千金藤屬植物中提取分離出來的生物堿之一,具有較強的生物活性。CEP臨床上主要用于治療腫瘤患者因放、化療及其它原因所致的白細胞減少癥。研究報道,CEP抑制TNF-α誘導的NF-κB的表達、血小板聚集、細胞因子生成,改善大鼠腎臟缺血再灌注損傷。諸多實驗研究表明千金藤素具有抗炎、抑制氧化應激、抗腫瘤、增強免疫功能等多種生物學作用。CEP還具有低毒、低廉的特點,如果能證實CEP為理想的神經保護劑,將具有重要的臨床意義,目前有關CEP在缺血損傷中的研究和應用鮮有報道。本研究選用雄性CD-1小鼠為研究對象,采用線栓法建立腦缺血模型,觀察腦缺血損傷后血腦屏障的改變及p38MAPK(mitogen-activated protein kinases)、JNK(c-jun N-terminal kinase)、NF-κB(nuclear factor-kappa B)及NLRP3、IL-1β等炎癥因子,并選用CEP進行干預,評價干預前后梗死體積、神經功能缺損評分。探討CEP對NF-κB和p38MAPK、JNK信號通路和NLRP3、IL-1β的抑制在缺血損傷誘導腦保護作用機制進行初步探討。本研究分三部分,現將各部分內容概述如下。第一部分千金藤素對局灶性腦缺血小鼠的腦保護作用目的:觀察局灶性腦缺血后神經功能缺損評分、腦梗死體積。研究千金藤素對腦缺血小鼠的神經保護作用,探討千金藤素神經保護作用的治療時間窗。方法:選用成年雄性CD-1小鼠為研究對象,采用改良線栓法制備大腦中動脈缺血模型。試驗隨機將CD-1小鼠分為5組:假手術組(Sham)、手術組(MCAO)、小劑量千金藤素干預組(CEP-10)(10 mg/kg)、中劑量千金藤素干預組(CEP-20)(20 mg/kg)、大劑量千金藤素干預組(CEP-40)(40mg/kg)。Sham組:假手術后即刻腹腔注射等量生理鹽水。MCAO組:術后即刻腹腔注射等量生理鹽水。CEP-10組:術后即刻腹腔注射千金藤素10 mg/kg。CEP-20組:術后即刻腹腔注射千金藤素20 mg/kg。CEP-40組:術后即刻腹腔注射千金藤素40 mg/kg。各組取材前進行神經功能評分,TTC染色評價腦梗死體積。結果:1 Sham組無神經功能缺損,神經功能缺損評分為0分;MCAO組在24 h和72 h神經功能缺損評分較重;CEP-10組在24 h和72 h與MCAO組相比神經功能缺損評分沒有明顯降低,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),CEP-20組和CEP-40組在24 h和72 h與MCAO組相比神經功能缺損評分明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2 CEP-10組的腦梗死體積在24 h和72 h與MCAO組相比均沒有顯著降低,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),CEP-20和CEP-40組的腦梗死體積在24 h和72 h分別與MCAO組相比均明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。據此以上的結果,表明千金藤素大劑量(40 mg/kg)和中劑量(20 mg/kg)可以發(fā)揮較好的治療效果,因此,我們選擇中劑量千金藤素組(20 mg/kg)進行探討其保護機制。結論:缺血后即刻腹腔注射千金藤素對局灶性腦缺血小鼠具有腦保護作用,能夠改善腦缺血損傷后的神經功能缺損和減小腦梗死體積。第二部分千金藤素對局灶性腦缺血小鼠血腦屏障的保護作用及其相關目的:觀察腦缺血損傷后血腦屏障的變化,研究千金藤素對局灶性腦缺血小鼠血腦屏障的保護作用,探討千金藤素對血腦屏障的保護作用的相關機制。方法:選用成年雄性CD-1小鼠小鼠為研究對象,采用改良線栓法制備大腦中動脈缺血模型。隨機將CD-1小鼠分為3組:假手術組(Sham)、手術組(MCAO)、中劑量千金藤素干預組(CEP-20)。Sham組:假手術后腹腔注射等量生理鹽水。MCAO組:術后即刻腹腔注射等量生理鹽水。CEP-20組:術后即刻腹腔注射千金藤素20 mg/kg。各組于取材前2小時即22小時給予尾靜脈注射伊文斯藍(4 mg/kg)染色測定伊文斯藍的相對含量。在大腦中動脈閉塞的24 h和72 h后,用干濕重法測定腦組織含水量,分別用q RT-PCR的方法和Western-blotting的方法檢測缺血腦組織中ZO-1、occludin、claudin-5 m RNA和蛋白水平的變化。結果:1 CEP-20組的腦組織含水量在24 h和72 h與MCAO組相明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2 CEP-20組在MCAO術后24 h病變側腦組織伊文斯藍含量明顯低于MCAO組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3通過Western-blotting發(fā)現,與MCAO組相比,CEP-20組ZO-1、occludin、claudin-5蛋白表達水平在24 h和72 h與MCAO組相比顯著增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4通過q RT-PCR發(fā)現,CEP-20組ZO-1、occludin和claudin-5 m RNA水平在24 h和72 h與MCAO組相比顯著增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:腦缺血后24 h和72 h,缺血腦組織的ZO-1、occludin和claudin-5顯著降低,而千金藤素能夠明顯上調ZO-1、occludin和claudin-5的表達,提示千金藤素減輕腦水腫、改善血腦屏障的通透性,保護血腦屏障,機制可能是通過上調ZO-1、occludin、claudin-5的表達發(fā)揮其腦保護作用。第三部分千金藤素對局灶性腦缺血小鼠的抗炎作用及其相關機制研究目的:觀察腦缺血損傷后炎癥因子的變化,研究千金藤素對局灶性腦缺血小鼠的抗炎作用,探討千金藤素抑制炎癥反應的相關機制。方法:選用成年雄性CD-1小鼠小鼠為研究對象,采用改良線栓法制備大腦中動脈缺血模型。隨機將CD-1小鼠分為3組:假手術組(Sham)、手術組(MCAO)、中劑量千金藤素干預組(CEP-20)。Sham組:假手術后腹腔注射等量生理鹽水。MCAO組:術后即刻腹腔注射等量生理鹽水。CEP-20組:術后即刻腹腔注射千金藤素20 mg/kg。分別用q RT-PCR的方法和Western-blotting的方法檢測缺血腦組織中NF-κB、phospho-p38MAPK、phospho-JNK、NALP3、IL-1β蛋白水平的變化和激光共聚焦技術測定NF-κB、NALP3、IL-1β的表達水平。結果:缺血后24 h和72 h,NF-κB、phospho-p38MAPK、phospho-JNK、NLRP3、IL-1β的表達均有升高,而千金藤素(20 mg/kg)降低局灶性腦缺血小鼠腦組織中NF-κB、phospho-p38MAPK、phospho-JNK、NLRP3、IL-1β的表達。1通過免疫組化染色分析發(fā)現,與MCAO組相比,CEP-20組NF-κB、p38MAPK、JNK、NALP3、IL-1β陽性細胞數在24 h和72 h均明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2通過激光共聚焦顯微鏡發(fā)現在神經元有NF-κB、NLRP3、IL-1β的表達。缺血后,NF-κB、NLRP3和IL-1β的表達量明顯增多,而千金藤素能夠抑制NLRP3、IL-1β的表達及NF-κB核轉位。3通過Western-blotting分析發(fā)現,CEP組NF-κB、phospho-p38MAPK、phospho-JNK、NALP3、IL-1β的蛋白水平在24 h和72 h與MCAO組相比顯著下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4與免疫組化染色分析和Western-blotting的結果相一致,CEP-20組NF-κB、NALP3和IL-1β的m RNA水平在24 h和72 h與MCAO組相比明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:局灶性腦缺血后誘導NLRP3、IL-1β表達升高,激活NF-κB和p38MAPK、JNK介導的炎癥反應,千金藤素可以抑制NLRP3、IL-1β的表達。因此,我們推測千金藤素可能通過抑制NLRP3、IL-1β,下調phospho-p38MAPK、phospho-JNK和NF-κB蛋白的表達,發(fā)揮其抗炎作用,從而減輕缺血腦組織的過度炎癥反應并最終實現其腦保護作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R743.31

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本文編號：2260425