【摘要】：髓母細(xì)胞瘤（medulloblastoma， MB）是最常見的兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤（占兒童顱內(nèi)腫瘤的12%-25%），，常起源于小腦蚓部或后髓帆，為WHOIV級腫瘤。兒童MB發(fā)病的高峰是3歲和7歲，MB在成人發(fā)病率較低（僅0.4%-1%），發(fā)病多在20-40歲。男女發(fā)病比約為1.3：1。臨床表現(xiàn)以顱內(nèi)壓增高的癥狀為主，頭痛伴有持續(xù)的嘔吐，當(dāng)腫瘤壓迫小腦時尚會出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)的體征，腫瘤還可隨腦脊液向脊髓蛛網(wǎng)膜下腔播散，使患者病情急劇惡化。目前治療方法以手術(shù)輔以放化療的綜合治療為主，這在很大程度上改善了患者預(yù)后，但隨之而來的是長期放化療的毒副作用，如神經(jīng)內(nèi)分泌障礙、生長發(fā)育遲緩、神經(jīng)心理及認(rèn)知功能障礙等。因此研究MB發(fā)病的分子機(jī)制，探索可用于治療的分子生物學(xué)新靶點有著重要的意義。 已有研究表明microRNAs是一類具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用的20-24個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，廣泛參與到細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、發(fā)育以及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Ferretti E等對34例MB及14例正常小腦組織利用實時定量PCR技術(shù)，建立了MBmiRNA表達(dá)文庫，其中位于染色體17p13.3的miR-22呈現(xiàn)低表達(dá)，而17p的缺失是MB染色體異常的一種重要的表現(xiàn)形式，這初步提示了miR-22在髓母細(xì)胞瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。為進(jìn)一步深入研究miR-22參與MB發(fā)病的分子機(jī)制，我們進(jìn)一步擴(kuò)大MB樣本量加以驗證，并進(jìn)行miR-22生物學(xué)功能分析，下游靶點篩查、驗證及生物學(xué)功能分析，初步闡明miR-22在髓母細(xì)胞瘤發(fā)病過程中的生物學(xué)作用。 實驗方法： 第一部分選取MB臨床標(biāo)本、原代培養(yǎng)細(xì)胞及MB細(xì)胞系利用qRT-PCR的方法檢測miR-22表達(dá)情況。并采用熒光原位雜交（Fluoresence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)，初步探討染色體17p位點是否存在雜合性缺失。 第二部分體外培養(yǎng)髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系并利用慢病毒表達(dá)載體進(jìn)行上調(diào)和下調(diào)miR-22的表達(dá)，行CCK-8檢測細(xì)胞增殖活性，并行流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。同時采用荷瘤小鼠模型在體研究miR-22過表達(dá)后對MB的影響。對過表達(dá)miR-22的MB細(xì)胞系行基因芯片篩查分析，并采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證miR-22新靶點。 第三部分在MB臨床標(biāo)本、原代細(xì)胞及MB細(xì)胞系中檢測PAPST1的表達(dá)，并在MB細(xì)胞系中下調(diào)PAPST1表達(dá)后CCK-8檢測細(xì)胞增殖活性的變化。 結(jié)果: 1. miR-22在MB中低表達(dá) （1）70%（19/27）的MB臨床標(biāo)本以及3株MB細(xì)胞系qRT-PCR結(jié)果提示存在miR-22的低表達(dá)（正常小腦組織表達(dá)水平的20%以下）。 （2）19%（5/27）的MB標(biāo)本存在17p13.3的丟失。 2. miR-22表達(dá)對MB細(xì)胞系增殖與凋亡的影響 （1）上調(diào)miR-22可以抑制MB細(xì)胞系的增殖活性，相反下調(diào)其表達(dá)可以增強(qiáng)MB細(xì)胞系的增殖活性。 （2）miR-22過表達(dá)可以促進(jìn)MB細(xì)胞系的凋亡。 （3）miR-22過表達(dá)可以抑制裸鼠腫瘤的生長促進(jìn)瘤細(xì)胞凋亡。 （4）PAPST1是miR-22的生物學(xué)新靶點 基因芯片提示miR-22上調(diào)后顯著抑制了PAPST1的表達(dá)，雙熒光素酶報告實驗證實PAPST1是miR-22的生物學(xué)新靶點。 3. PAPST1在MB中的表達(dá)及其對MB細(xì)胞增殖特性的影響 （1）67%（18/27）的MB臨床標(biāo)本以及2株MB細(xì)胞系qRT-PCR結(jié)果提示存在PAPST1的高表達(dá)（正常小腦組織表達(dá)水平的2倍以上）。 （2）PAPST1免疫組織化學(xué)顯示棕褐色的顆粒分布于細(xì)胞漿，且著色明顯強(qiáng)于正常小腦組織。 （3）下調(diào)PAPST1表達(dá)后MB細(xì)胞系增殖活性降低。 結(jié)論： miR-22在髓母細(xì)胞瘤中常表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)水平通常與髓母細(xì)胞瘤體外增殖活性呈負(fù)相關(guān)，過表達(dá)miR-22在體內(nèi)、體外均可以誘導(dǎo)髓母細(xì)胞瘤凋亡，抑制腫瘤生長。 PAPST1是miR-22的新靶點，在髓母細(xì)胞瘤中普遍高表達(dá)，其表達(dá)下調(diào)可以抑制髓母細(xì)胞瘤的增殖活性。
[Abstract]:Medulloblastoma (MB) is the most common central nervous system tumor in children (12% - 25% of intracranial tumors in children). It usually originates from the cerebellar vermis or posterior medullary velum and is a WHO grade IV tumor. The peak incidence of MB in children is 3 and 7 years old, and the incidence of MB in adults is low (only 0.4% - 1%). The incidence of MB in men and women is about 1.3:1. The clinical manifestations are mainly symptoms of increased intracranial pressure, headache accompanied by persistent vomiting. When the tumor oppresses the cerebellum, there will be ataxia. The tumor can also spread to the spinal subarachnoid space with cerebrospinal fluid, making the patient's condition deteriorate sharply. It improves the prognosis of patients, but the side effects of long-term radiotherapy and chemotherapy, such as neuroendocrine disorders, growth retardation, neuropsychological and cognitive dysfunction, etc. Therefore, it is important to study the molecular mechanism of MB pathogenesis and explore new molecular biological targets for treatment.
Studies have shown that microRNAs are endogenous, non-coding, 20-24 nucleotides with post-transcriptional regulation. They are widely involved in cell proliferation, apoptosis, differentiation, development, and tumorigenesis and development. Among them, the expression of microRNA-22 on chromosome 17p13.3 is low, and the deletion of 17p is an important manifestation of abnormal MB chromosome, which preliminarily suggests that microRNA-22 plays an important role in the occurrence and development of medulloblastoma. To validate and analyze the biological function of microRNAs-22, screening downstream targets, validation and biological function analysis, and preliminarily elucidate the biological role of microRNAs-22 in the pathogenesis of medulloblastoma.
Experimental methods:
In the first part, MB clinical specimens were selected, primary cultured cells and MB cell lines were used to detect the expression of microRNA-22 by qRT-PCR, and fluorescence in situ hybridization (FISH) technique was used to investigate the presence of loss of heterozygosity at chromosome 17p locus.
In the second part, Medulloblastoma cell lines were cultured in vitro and up-regulated and down-regulated by lentiviral expression vector. Cell proliferation activity was detected by CCK-8 and apoptosis was detected by flow cytometry. The effect of overexpression of miR-22 on MB was studied in vivo using tumor-bearing mice model. Gene chip screening and analysis, and dual luciferase reporter system was used to verify the new target of miR-22.
In the third part, the expression of PAPST1 was detected in MB clinical specimens, primary cells and MB cell lines, and the changes of cell proliferation activity were detected by CCK-8 after down-regulation of PAPST1 expression in MB cell lines.
Result:
1. low expression of miR-22 in MB
(1) 70% (19/27) of MB clinical specimens and 3 strains of MB cell lines showed low expression of microRNAs-22 (less than 20% of normal cerebellar tissue).
(2) there was a loss of 17p13.3 in MB specimens of 19% (5/27).
Effect of 2. miR-22 expression on proliferation and apoptosis of MB cell line
(1) Up-regulation of miR-22 can inhibit the proliferation of MB cell lines, but down-regulation of its expression can enhance the proliferation of MB cell lines.
(2) over expression of miR-22 can promote the apoptosis of MB cell line.
(3) over expression of miR-22 can inhibit tumor growth and promote apoptosis in nude mice.
(4) PAPST1 is a new biological target for miR-22.
Microarray analysis indicated that up-regulation of microarray RNA-22 significantly inhibited the expression of PAPST1. Double luciferase assay confirmed that PAPST1 was a new biological target of microarray RNA-22.
Expression of 3. PAPST1 in MB and its effect on proliferation of MB cells
(1) 67% (18/27) of MB clinical specimens and 2 strains of MB cell lines showed high expression of PAPST1 (more than twice the expression level in normal cerebellum).
(2) PAPST1 immunohistochemistry showed that brown granules were distributed in the cytoplasm, and the staining was stronger than that of normal cerebellum.
(3) after downregulation of PAPST1 expression, the proliferation activity of MB cell line decreased.
Conclusion: Mi-22 is often down-regulated in medulloblastoma, and its expression level is usually negatively correlated with the proliferative activity of medulloblastoma in vitro. Overexpression of Mi-22 can induce apoptosis and inhibit the growth of medulloblastoma in vitro.
PAPST1 is a novel target of microRNAs-22, which is highly expressed in medulloblastoma and its down-regulation can inhibit the proliferation of medulloblastoma.
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2250356