【摘要】：帕金森病為僅次于阿爾茲海默病的人類第二大神經(jīng)退行性病變。帕金森病的發(fā)病率伴隨著年齡的增加而增加,60歲以上的人群中發(fā)病率為1-4%。主要的臨床表現(xiàn)有肌肉僵直、震顫、運(yùn)動遲緩以及姿勢不穩(wěn)定等。帕金森病的病理特征主要有多巴胺能神經(jīng)元的丟失,路易小體的沉積以及膠質(zhì)細(xì)胞的活化等等。盡管目前帕金森病的發(fā)病原因不明,但主要認(rèn)為與衰老、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、DNA損傷等等因素有關(guān)。臨床上,左旋多巴是治療帕金森病的一線藥物,但僅能改善癥狀并不能逆轉(zhuǎn)帕金森病的發(fā)生、發(fā)展。目前,尋找新的帕金森病治療靶標(biāo)、研究新型治療藥物十分緊迫和必要。 帕金森病人腦片上不僅發(fā)現(xiàn)有多巴胺能神經(jīng)元的變性、壞死還有星形膠質(zhì)細(xì)胞大量的活化、增生。星形膠質(zhì)細(xì)胞參與了多種包括帕金森病在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病。星形膠質(zhì)細(xì)胞在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)定上發(fā)揮了重要作用,包括突觸谷胱甘肽的攝取、細(xì)胞內(nèi)外K離子水平的穩(wěn)定以及提供神經(jīng)元多種神經(jīng)營養(yǎng)因子等。 環(huán)境應(yīng)答基因JWA,是一種新的微管結(jié)合蛋白,通過MAPK信號通路調(diào)節(jié)癌癥細(xì)胞的遷移以及介導(dǎo)白血病細(xì)胞的分化。JWA通過調(diào)控XRCC1的表達(dá)參與DNA損傷后的BER修復(fù)通路,參與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)。JWA不僅參與氧化還原平衡且參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。雖然JWA發(fā)揮著多樣作用,但是其在帕金森病方面研究目前還沒有相關(guān)報道。本研究中我們主要從構(gòu)建條件性星形膠質(zhì)細(xì)胞JWA剔除小鼠入手,研究星形膠質(zhì)細(xì)胞中JWA對帕金森病多巴胺能神經(jīng)元的影響。 目的：在整體動物、細(xì)胞和分子水平探討星形膠質(zhì)細(xì)胞中JWA的表達(dá)對帕金森病多巴胺能神經(jīng)元功能的影響及機(jī)制。 方法：1、繁殖3月齡雄性C57BL/6J野生型小鼠(JWAloxp/loxp)及條件性星形膠質(zhì)細(xì)胞JWA剔除小鼠(JWAΔ2/Δ2/GFAP-Cre)。2、應(yīng)用酪氨酸羥化酶免疫組織化學(xué)結(jié)合體視學(xué)計數(shù)分析黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的損傷,同時應(yīng)用尼氏染色結(jié)合體視學(xué)計數(shù)分析中腦神經(jīng)元的損傷；檢測中腦黑質(zhì)致密部星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化。3、運(yùn)用高效液相色譜法測定單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量。4、運(yùn)用免疫熒光雙標(biāo)來檢測中腦多巴胺能神經(jīng)元中活性氧的含量以及運(yùn)用流式檢測給予MPP+50μM24h人星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U251細(xì)胞)內(nèi)活性氧含量的變化。5、應(yīng)用谷胱甘肽試劑盒檢測給予MPP+50μM24h后谷胱甘肽的含量。6、應(yīng)用Western-blotting法來檢測給予MPP+50μM24h后U251細(xì)胞的Iκβ、IκB、胞漿胞核p65分子含量變化以及檢測中腦組織中Ikkβ、IκB、胞漿胞核p65的分子含量變化。 結(jié)果：1. JWAΔ2/Δ2/GFAP-Cre小鼠導(dǎo)致中腦黑質(zhì)致密部星形膠質(zhì)細(xì)胞顯著活化(1.34×103±74.5vs.8.44×103±1.35×103, P0.01)并伴有多巴胺能神經(jīng)元的丟失(1.03×104±238vs.6.17×103±392, P0.001)。2. JWAΔ2/Δ2/GFAP-Cre小鼠多巴胺含量顯著升高(11.1±1.79nmol/g vs.22.5±2.23nmol/g, P0.01)。但是DOPAC/DA(3.28±0.414vs.2.02±0.285, P0.05)以及HVA(13.8±0.742nmol/g vs.10.6±0.870nmol/g, P0.05)相對于對照小鼠顯著降低。3.JWA缺乏顯著加劇中腦多巴胺能神經(jīng)元活性氧的聚積。在U251細(xì)胞中增加JWA的表達(dá)可以顯著抑制活性氧水平(3.60×104±572vs2.87×104±397,P0.001)且顯著增加谷胱甘肽的含量(298±0.667vs.365±7.09, P0.001)。4. JWAΔ2/Δ2/GFAP-Cre小鼠中腦組織細(xì)胞核內(nèi)p65的表達(dá)是對照小鼠JWALoxp/Loxp的1.76倍(P0.01)；IKKβ的含量是對照小鼠的1.7倍(P0.05),而IκκC的表達(dá)是對照小鼠的0.5倍(P0.001)。在體外模型中,給予U251細(xì)胞MPP+(50μM)24h后,高表達(dá)JWA的U251細(xì)胞核內(nèi)p65表達(dá)量是對照組的70%(P0.001),而胞漿p65的表達(dá)量是對照組的2.1倍(P0.01)；高表達(dá)JWA組IκκC的表達(dá)是對照組的1.7倍,IKKβ和p-p65的表達(dá)分別是對照組的0.6和0.5倍(P0.001)。 結(jié)論：環(huán)境應(yīng)答基因拮抗PD的發(fā)生的作用以及機(jī)制研究：1.條件性星形膠質(zhì)細(xì)胞JWA基因剔除(JWA△2/△2／GFAP-Cre)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活化且促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元的丟失,JWA基因在體內(nèi)體外模型中對多巴胺能神經(jīng)元起保護(hù)作用。2.條件性星形膠質(zhì)細(xì)胞JWA基因剔除通過JWA-IKKβ-NF-κB信號通路導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的損傷。
[Abstract]:Parkinson's disease is the second largest neurodegenerative disorder in humans after Alzheimer's disease. The incidence of Parkinson's disease increases with age. The incidence of Parkinson's disease is 1-4% in people over the age of 60. The main clinical manifestations are muscle stiffness, tremor, motor retardation and postural instability. Loss of dopaminergic neurons, deposition of Lewis bodies, activation of glial cells and so on. Although the etiology of Parkinson's disease is unknown, it is mainly associated with aging, oxidative stress, inflammation, DNA damage and other factors. It can reverse the occurrence and development of Parkinson's disease. At present, it is very urgent and necessary to find new targets for the treatment of Parkinson's disease and study new therapeutic drugs.
In Parkinson's disease, not only degeneration of dopaminergic neurons, necrosis, but also activation and proliferation of astrocytes have been found. Astrocytes are involved in a variety of neurodegenerative diseases including Parkinson's disease. Astrocytes play an important role in maintaining the stability of the central nervous system, including synaptic glutathione. The uptake of glycine, the stability of intracellular and extracellular K ions, and the availability of various neurotrophic factors in neurons.
JWA, a novel microtubule-binding protein, regulates the migration of cancer cells and mediates the differentiation of leukemia cells through MAPK signaling. JWA participates in the BER repair pathway after DNA damage by regulating the expression of XRCC1. JWA participates in the repair of DNA damage induced by oxidative stress. Inflammation. Although JWA plays a variety of roles, its research on Parkinson's disease has not been reported. In this study, we mainly constructed conditioned astrocyte JWA knockout mice to study the effect of JWA on dopaminergic neurons in Parkinson's disease.
AIM: To investigate the effect of JWA expression in astrocytes on the function of dopaminergic neurons in Parkinson's disease at the animal, cellular and molecular levels.
METHODS: 1. Three-month-old male C57BL/6J wild-type mice (JWA loxp/loxp) and conditioned astrocyte JWA knockout mice (JWA 2/2/GFAP-Cre). 2. The damage of dopaminergic neurons in substantia nigra compact was analyzed by tyrosine hydroxylase immunohistochemical binding stereological counting and Nissl's staining binding stereological counting. To analyze the damage of mesencephalic neurons; to detect the activation of astrocytes in the compact part of substantia nigra. 3. To determine the content of monoamine neurotransmitters by high performance liquid chromatography. 4. To detect the content of reactive oxygen species in mesencephalic dopaminergic neurons by immunofluorescence double labeling and to detect the content of MPP + 50 mu M24 h human astrocytoma cells by flow cytometry. 5. Glutathione assay kit was used to detect the content of glutathione. 6. Western-blotting was used to detect the content of I-kappa beta, I-kappa B, p65 in nucleus and Ikk-beta, I-kappa B in mesencephalic tissue. Change.
Results: 1. JWA2/2/GFAP-Cre mice significantly activated astrocytes in the substantia nigra compacta (1.34 *103 +74.5 vs. 8.44 *103 +1.35 *103, P However, DOPAC/DA (3.28+0.414 vs.2.02+0.285, P 0.05) and HVA (13.8+0.742 nmol/g vs.10.6+0.870 nmol/g, P 0.05) decreased significantly compared with the control mice. 3. JWA deficiency significantly increased the accumulation of reactive oxygen species in mesencephalic dopaminergic neurons. Increasing the expression of JWA in U251 cells significantly inhibited the accumulation of reactive oxygen species (ROS). The expression of p65 in the nucleus of JWA2/2/GFAP-Cre mice was 1.76 times as high as that of JWALoxp/Loxp (P 0.01), the content of IKK beta was 1.7 times as high as that of control mice (P 0.05), and the expression of Ikappa C was 1.76 times as high as that of control mice (P 0.05). The expression of p65 in U251 nucleus was 70% (P 0.001) and that in cytoplasm was 2.1 times (P 0.01) of the control group. The expression of Ikappa-kappa C was 1.7 times of the control group, and the expression of IKK-beta and p-p65 were 0.6 and 0.6 times of the control group, respectively. 5 times (P0.001).
CONCLUSIONS: Environmental response genes antagonize the development of PD and its mechanism: 1. Conditioned astrocyte JWA gene knockout (JWA {2 / {2}/ GFAP-Cre} mice astrocytes activate and promote the loss of dopaminergic neurons. JWA gene plays a protective role on dopaminergic neurons in vitro and in vivo. 2. JWA gene knockout in astrocytes results in damage to dopaminergic neurons via JWA-IKK beta-NF-kappa B signaling pathway.
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R742.5

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