【摘要】：目的：研究miR-26a對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）細(xì)胞放療敏感性的影響，并探索其相關(guān)分子學(xué)機(jī)制，深入了解miR-26a在GBM放療敏感性方面的潛在意義，為GBM的個體化治療提供更多的分子學(xué)基礎(chǔ)。 方法：利用Real-time PCR檢測U251、A172、T98g三種放療敏感性不同的GBM細(xì)胞系中miR-26a的表達(dá)水平；構(gòu)建miR-26a過表達(dá)和敲低的GBM細(xì)胞系穩(wěn)定株，進(jìn)行克隆形成實驗；利用流式細(xì)胞術(shù)測定miR-26a過表達(dá)后的GBM細(xì)胞周期變化；通過BrdU細(xì)胞增殖實驗觀察miR-26a對GBM細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)測定放療之后miR-26a過表達(dá)的GBM細(xì)胞的凋亡情況；單細(xì)胞免疫熒光實驗（γH2AX fociassay）以及彗星實驗判定miR-26a對GBM細(xì)胞DNA修復(fù)的影響；通過miRanda預(yù)測miR-26a的可能靶點，并結(jié)合雙熒光素酶報告實驗進(jìn)一步驗證； Western Blot檢測在過表達(dá)和敲低miR-26a之后，ATM以及下游因子p-CHK2和p53的變化；構(gòu)建原位膠質(zhì)瘤動物模型，，利用MRI磁共振成像觀察放療前后GBM腫瘤的體積變化，并進(jìn)行生存分析。 結(jié)果：U251、A172、T98g三種GBM細(xì)胞系中，miR-26a的表達(dá)水平與細(xì)胞放療敏感性相一致；相對于空載體對照組而言，miR-26a敲低的U87和U251細(xì)胞接受放療后具有較多的克隆數(shù)(P＜0.05)，而miR-26a過表達(dá)后則克隆數(shù)減少(P＜0.05)；過表達(dá)miR-26a之后， U87細(xì)胞的S期縮短(P＜0.05)，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)(P＜0.05)，且接受放療之后的細(xì)胞凋亡比例較增高（P＜0.001）；接受放療之后，相對于空載體對照組，miR-26a敲低的U87細(xì)胞中γH2AX foci的數(shù)量較少（P＜0.05），彗星尾的長度較短（P＜0.05），而在miR-26a過表達(dá)的U87細(xì)胞中則相反；miR-26a可靶向作用于ATM，并進(jìn)一步誘使其下游因子p-CHK2和p53的表達(dá)水平降低；動物實驗顯示miR-26a過表達(dá)的原位膠質(zhì)瘤小鼠在接受放療后腫瘤體積較�。≒＜0.05），生存周期更長（P＜0.05）。 結(jié)論：miR-26a可靶向作用于ATM，進(jìn)而影響同源重組修復(fù)通路，降低GBM細(xì)胞的DNA修復(fù)能力，并最終增強(qiáng)了GBM細(xì)胞的放療敏感性。
[Abstract]:Objective: to study the effect of miR-26a on the radiosensitivity of glioblastoma (glioblastoma multiforme,GBM) cells and explore its molecular mechanism, to understand the potential significance of miR-26a in GBM radiosensitivity, and to provide more molecular basis for the individualized treatment of GBM. Methods: Real-time PCR was used to detect the expression of miR-26a in three GBM cell lines with different radiosensitivity to radiotherapy, and to construct a stable cell line of GBM with miR-26a overexpression and knockdown. The changes of GBM cell cycle after overexpression of miR-26a were measured by flow cytometry, the effect of miR-26a on the proliferation of GBM cells was observed by BrdU cell proliferation assay, the apoptosis of GBM cells with miR-26a overexpression after radiotherapy was measured by flow cytometry. Single cell immunofluorescence assay (緯 H2AX fociassay) and comet assay were used to determine the effect of miR-26a on DNA repair in GBM cells. The possible targets of miR-26a were predicted by miRanda and further verified by double luciferase report. Western Blot was used to detect the changes of miR-26a and its downstream factors, p-CHK2 and p53 after overexpression and knockdown. An in situ glioma model was established, and the volume changes of GBM tumors before and after radiotherapy were observed by MRI magnetic resonance imaging, and survival analysis was performed. Results the expression level of miR-26a in the three GBM cell lines was consistent with the radiosensitivity of the cells. Compared with the control group of empty vector, U87 and U251 cells with low knockout of miR-26a had more clones after radiotherapy (P < 0. 05), but the number of clones decreased after overexpression of miR-26a (P < 0. 05). After overexpression of miR-26a, the S phase of U87 cells was shortened (P < 0. 05), the proliferation of U87 cells was increased (P < 0. 05), and the percentage of apoptosis was increased after radiotherapy (P < 0.001). Compared with the empty vector control group, the number of 緯 H2AX foci in U87 cells was lower than that in the control group (P < 0. 05), and the length of comet tail was shorter (P < 0. 05), whereas in U87 cells with overexpression of miR-26a, the number of 緯 H2AX foci was lower (P < 0. 05). MiR-26a could target ATM, and further induce the lower expression of p-CHK2 and p53, and the animal experiment showed that the tumor volume of miR-26a overexpression was smaller and the survival period was longer (P < 0. 05). ConclusionTwo miR-26a can target ATM, and then affect the homologous recombination repair pathway, reduce the DNA repair ability of GBM cells, and enhance the radiosensitivity of GBM cells.
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.4

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2237194